王新利，李卿，蔣濤，王揚(yáng)，付立葉，高婷，姜又紅

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所第二研究室，沈陽(yáng)110001）

自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別無(wú)主要組織相容性復(fù)合體﹙major histocompatibility complex，MHC﹚限制性，是機(jī)體抗感染免疫、抗腫瘤免疫及清除非己細(xì)胞的第一道防線［1］。MICA/B（MHC class I chain-related gene A/B）是NK細(xì)胞表面活化性受體NKG2D的配體，在正常情況下，MICA/B僅表達(dá)于胃腸上皮中，在感染、應(yīng)激或癌變等條件下表達(dá)上調(diào)［2］。Bauer等［3］研究發(fā)現(xiàn)正常表達(dá) MHC-I類(lèi)分子的靶細(xì)胞在轉(zhuǎn)染表達(dá)MICA后，對(duì)NK細(xì)胞殺傷的敏感性增強(qiáng)。本研究檢測(cè)4種腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)，并探討其表達(dá)與NK細(xì)胞殺傷敏感性的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 NK細(xì)胞的純化：取9例健康志愿者外周血，分別取抗凝血20 ml，輕輕疊加于Ficoll上，室溫下2000 r/min離心20 min，吸取界面層的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood monouclear cell，PBMC）并收集沉淀紅細(xì)胞，分別用PBS洗滌2次并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將紅細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞按100︰1混合，1500 r/min離心15 min，棄上清，加1 ml PBS重懸細(xì)胞，加入20 μl RosetteSep抗體復(fù)合物（1×106PBMC/1 μl RosetteSep抗體復(fù)合物），室溫下孵育20 min，加入含2%FBS的等體積PBS，輕輕混合，置于等體積的Ficoll上，以2000 r/min離心20 min，吸取界面層細(xì)胞，用含2%FBS的PBS洗滌2次并計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3-CD56+細(xì)胞的純度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：NK細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS，500 U/ml IL-2的RPMI1640完全培養(yǎng)基中；腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)于10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基中。細(xì)胞均置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 腫瘤細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)：采用直接免疫熒光法測(cè)定，收集腫瘤細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取1×106個(gè)細(xì)胞，加入20 μl MICA/B-APC 抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌3次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 CCK-8法測(cè)定NK細(xì)胞殺瘤活性：以培養(yǎng)24 h后的NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562，Bcap37，769P，A549細(xì)胞為靶細(xì)胞，調(diào)整靶細(xì)胞濃度為5×104/ml，按效靶比5︰1﹑10︰1﹑20︰1 混合后，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入15 μl CCK-8，37℃繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)OD值，計(jì)算殺傷率。殺傷率（%）=［1-﹙實(shí)驗(yàn)組OD值-單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞OD值）/單獨(dú)靶細(xì)胞OD值］×100。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，多樣本均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，差別的多重比較采用LSD法。腫瘤細(xì)胞MICA/B的表達(dá)與NK細(xì)胞殺傷敏感性的相關(guān)分析采用雙變量相關(guān)分析Spearman法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NK細(xì)胞的分離純度

2.2 腫瘤細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)

流式細(xì)胞儀檢測(cè) K562、Bcap37、769P及 A549表面MICA/B的表達(dá)陽(yáng)性率分別是（60.35±0.50）%、（90.72±0.64）%、（55.59±0.55）%、（3.84±0.10）%，兩兩比較，差異均具顯著性（P＜0.01）。

2.3 NK細(xì)胞的殺傷活性檢測(cè)

NK細(xì)胞對(duì)同一腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，在不同效靶比之間，差異有顯著性（P＜0.01）；在同一效靶比時(shí)，NK細(xì)胞對(duì)K562、Bcap37及769P的殺傷活性較強(qiáng)，與A549相比有顯著性差異（P＜0.01），其中K562與Bcap37之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 NK細(xì)胞的殺瘤活性與腫瘤細(xì)胞表面MICA/B表達(dá)的相關(guān)性分析

雙變量相關(guān)分析結(jié)果顯示，在效靶比為5∶1、10∶1、20∶1 時(shí)，K562、Bcap37、769P 及 A549 細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)與NK細(xì)胞的殺瘤活性均呈正相關(guān)關(guān)系，見(jiàn)表2。對(duì)同一腫瘤細(xì)胞，隨著效靶比增加，相關(guān)性增強(qiáng)。

3 討論

NK細(xì)胞是機(jī)體天然免疫的主要承擔(dān)者，其功能受其表面的激活性受體和抑制性受體之間平衡機(jī)制的調(diào)節(jié)。正常情況下，NK細(xì)胞通過(guò)表面的抑制性受體識(shí)別自身的MHC-I類(lèi)分子，保護(hù)正常細(xì)胞免受NK細(xì)胞的攻擊［4］。NK細(xì)胞的活化受體NKG2D是C-型凝集素受體成員之一，主要表達(dá)在NK細(xì)胞、γ ζT細(xì)胞及部分CD8+T細(xì)胞［5］。MICA/B作為NKG2D的主要配體，是人白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）復(fù)合體中的MICA基因編碼的非經(jīng)典HLA-I類(lèi)分子，正常情況下僅在胃腸道上皮細(xì)胞表面有少量表達(dá)，感染、腫瘤惡性轉(zhuǎn)化等條件能誘導(dǎo)表達(dá)。NKG2D與MICA/B結(jié)合，在多肽DAP10的介導(dǎo)下激活NK細(xì)胞的殺傷活性，并且活化效應(yīng)能克服靶細(xì)胞上經(jīng)典HLA-I類(lèi)分子誘導(dǎo)的抑制性效應(yīng)，在NK細(xì)胞的活化中起著非常重要的作用［6］。研究表明MICA表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的殺傷敏感性明顯高于MICA陰性者［7］，被轉(zhuǎn)染以MICA/B的腫瘤細(xì)胞系對(duì)NK細(xì)胞殺傷的敏感性明顯增強(qiáng)［8］。因此，NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性與靶細(xì)胞表面的配體表達(dá)關(guān)系密切。

本研究發(fā)現(xiàn)，K562、Bcap37、769P表達(dá)高水平的MICA/B，并且對(duì)NK細(xì)胞的殺傷比較敏感，而對(duì)NK細(xì)胞低敏感的A549表面MICA/B的表達(dá)水平極低，雙變量相關(guān)分析表明，在不同效靶比時(shí)4種腫瘤細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)與NK細(xì)胞的殺傷敏感性呈正相關(guān)，說(shuō)明MICA/B的表達(dá)在NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用。

根據(jù)MICA/B在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)特點(diǎn)，已有研究表明用抗MICA抗體調(diào)理的腫瘤細(xì)胞負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC），能引起腫瘤抗原特異性 T 細(xì)胞的活化［9］；Watson等［10］對(duì) 449例直腸結(jié)腸癌的研究發(fā)現(xiàn)，MICA表達(dá)低的患者預(yù)后差，MICA可作為預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)之一。因此，深入研究腫瘤細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)，會(huì)為抗腫瘤免疫提供新的思路。

［1］KimR，EmiM，TanabeK.Cancerimmunoeditingfromimmune surveillance to immune escape［J］.Immunology，2007，121﹙1﹚：1-14.

［2］Cerwenka A，Lanier LL.NKG2D ligands：unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer［J］.Tissue Antigen，2003，61（5）：335-343.

［3］Bauer S，Groh V，Wu J，et al.Activation of NK cells and T cells by NKG2D，a receptorforstress-inducibleMICA ［J］.Science，1999，285（5428）：727-729.

［4］Farag SS，F(xiàn)ehniger TA，Ruggeri L，et al.Natural killer cell receptors：new biology and insights into the graft-versus-leukemia effect［J］.Blood，2002，100（6）：1935-1947.

［5］Vivier E，Tomasello E，Paul P.Lymphocyte activiton via NKG2D：Towards a new paradigm in immune recognition ［J］.Curr Opin Immunol，2002，14（3）：306-311.

［6］Raulet DH.Roles of the NKG2D immunoreceptor and its ligands［J］.Nat Rev Immunol，2003，3﹙10﹚：781-790.

［7］張彩，許曉群，張建華.MHCI類(lèi)樣分子（MICA）在部分腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)及臨床意義［J］.中國(guó)腫瘤臨床，2005，32（21）：1208-1211.

［8］Nowbakht P，Slonescu MC，Rohner A，et al.Ligands for natural killer cell activating receptors are expressed upon the maturation of normal myelomonocytic cells but at low levels in acute myeloid leukimias［J］.Blood，2005，105（9）：3615-3622.

［9］Groh V，Li YQ，Cioca D，et al.Efficient cross-priming of tumor antigen-specific T cells by dendritic cells sensitized with diverse anti-MICA opsonized tumor cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（18）：6461-6466.

［10］Watson NF，Spendlove I，Madjd Z，Expression of the stress-related MHC class I chain-related protein MICA is an indicator of good prognosis in colorectal cancer patients［J］.Int J Cancer，2006，118（6）：1445-1452.