韓振坤，孫建波，劉丹，胡海洋，陳大為，顧鵬毅，趙敏

（1.中國醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院急診科，沈陽110004；2.沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，沈陽110016；3.中國醫(yī)科大學(xué) 實驗技術(shù)中心，沈陽110001）

對氧磷酶（paraoxonase，PON）是1953年被發(fā)現(xiàn)的一種能夠水解磷酸酯鍵的A2酯酶，其家族至少有3個成員PON1、PON2和PON3。PON1是其中發(fā)現(xiàn)最早，研究最多的一個成員。我們對兔血清PON1進行了提取和純化［1］，目前，PON1活性改變與有機磷中毒［2］、心腦血管疾?。?，4］、妊娠期高血壓疾病、細菌擴散能力及耐藥性均有關(guān)。

PON1在有機磷酸代謝中具有重要作用，它不但能催化磷酸酯鍵的水解，降解有機磷酸、芳香羥基酸酯和氨基甲酸酯，還能夠水解包括有機磷殺蟲劑制品對氧磷、二秦噥（DZO）和毒死蜱等寬范圍的底物。除此之外也水解神經(jīng)毒劑沙林、梭曼和VX［5］。Furlong實驗室做了大量的研究，并且在有機磷暴露前后通過給大鼠和小鼠注射從兔血清純化的PON1，證明了PON1治療的潛在可能性［6］，被認為是一個開發(fā)治療有機磷暴露和中毒有前途的方法。蛋白類藥物與傳統(tǒng)藥物相比，有半衰期短、清除率高、分子量大、易受體內(nèi)酶和細菌以及體液破壞等特點。聚乙二醇修飾的長循環(huán)脂質(zhì)體作為蛋白質(zhì)藥物載體，能避開網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，增加脂質(zhì)體的血液循環(huán)時間，從而達到持續(xù)、緩慢釋放藥物的目的。本實驗采用薄膜分散法制備了聚乙二醇修飾的對氧磷酶長循環(huán)脂質(zhì)體（PEG-modified PON1 long circulating liposome，PEG-PON1-LCL），在酶活性穩(wěn)定的前提下，以包封率為指標(biāo)，對各處方因素進行了考察，并應(yīng)用正交設(shè)計進行處方優(yōu)化，確定了對氧磷酶聚乙二醇化長循環(huán)脂質(zhì)體的最優(yōu)處方，測定了其粒度分布并對其穩(wěn)定性進行了初步考察。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆卵磷脂（soybean phosphatidyl choline，SPC，上海泰偉藥業(yè)有限公司）；膽固醇（天津市博迪化工有限公司）；Sepharose CL-6B（瑞典Pharmacia公司）；乙酸苯脂（分析純，美國Sigma公司）；牛血清白蛋白（美國Amresco公司）；考馬斯亮藍G-250（Coomassie Brilliant Blue，CBB，美國 Amresco公司）；其余試劑均為分析純。

FA1104電子天平（上海民橋精密儀器科技有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪華儀器廠）；RE-53A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；UV-9100型紫外分光光度計（北京瑞利分析儀器廠）；LS230激光粒度儀（美國Coulter公司）；Nicomp TM380動態(tài)光散射粒度-zeta電位測定儀（美國PSS公司）；JY92-ⅡDN超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；JEM-1200EX透射電鏡（日本電子公司）；UV-1601分光光度計（日本島津公司）。

1.2 方法

1.2.1 兔血清中對氧磷酶的提取和純化：根據(jù)文獻［7］，首先使用Cibacron Blue3GA瓊脂糖為介質(zhì)的親和層析，之后以Sepharose Fast Flow為介質(zhì)進行兩次陰離子交換層析。收集蛋白后Centrplus YM-10離心超濾（美國Millipore）使蛋白濃縮、除鹽，4℃保存。

1.2.2 血清對氧磷酶活性檢測：參考文獻［8］采用乙酸苯酯法測定PON1活性。PON1活性單位用U/ml表示，1U為對氧磷酶每分鐘水解1 μmol的乙酸苯酯。

PON（U/ml）=△A/min×TV×106/（SV×L×ε）

其中△A/min為每分鐘吸光度變化值；TV為反應(yīng)總體積（ml）；SV 為樣本體積（ml）；L 為比色杯光徑（cm）；ε為對硝基酚的摩爾消光系數(shù)（1.31×106cm/mol）。

1.2.3 脂質(zhì)體制備對對氧磷酶活性的影響：為了考察脂質(zhì)體制備過程是否影響對氧磷酶的活性，分別對膽固醇、磷脂、空白脂質(zhì)體、載酶脂質(zhì)體、二氯甲烷、37℃水?。?0 min）、冰浴超聲（200 w，3 min）、膽固醇+酶、磷脂+酶、酶+10%Triton等制備因素對酶活性的影響進行了考察，酶活性測定方法同1.2.2。

1.2.4 PEG-PON1-LCL的制備：應(yīng)用薄膜分散法制備聚乙二醇化脂質(zhì)體，按處方量精密稱取磷脂、膽固醇及聚乙二醇-膽固醇于西林瓶中，用二氯甲烷完全溶解后，置于磨口茄形瓶中，于37℃水浴、100 r/min條件下，減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，磷脂等成膜材料于瓶底形成均一薄膜，加入PON1 HEPES緩沖液，充分水化后冰浴超聲（200 w）3 min，過0.22 μm微孔濾膜，即得聚乙二醇化脂質(zhì)體。

1.2.5 考馬斯亮藍標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：按標(biāo)準(zhǔn)配置不同濃度的牛血清白蛋白溶液，以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)（μ g），吸光值（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 凝膠柱法測定PEG-PON1-LCL的包封率

1.2.6.1 洗脫曲線的考察：精密吸取聚乙二醇化脂質(zhì)體混懸液5.0 ml，緩緩加入柱長為20 cm的Sepharose CL-6B凝膠柱頂部（r=1.25 cm），洗脫液為pH 8.0 的 HEPES 緩沖液，流速0.5 ml·min-1，分管收集濾過液，各管號收集體積：1、2、3、4為4 ml，第5管為1.5 ml，6、7、8、9 各為 4 ml，1～4 管濾過液破乳（甲醇）后定容至10 ml，用考馬斯亮藍G-250染料法測定對氧磷酶量（圖1）。

結(jié)果表明，脂質(zhì)體與游離的對氧磷酶組分之間分離度較好，重復(fù)測定的結(jié)果偏差較小。

1.2.6.2 包封率（encapsulation efficiency，EE）的測定：取制備聚乙二醇化脂質(zhì)體在Sepharose CL-6B凝膠柱上樣，對脂質(zhì)體和未包封的游離對氧磷酶進行分離，用考馬斯亮藍G-250染料法測定游離對氧磷酶量，按以下公式計算包封率：

包封率 EE=（A總-A游離）/A總×100%

其中，A游離游離對氧磷酶的量；A總為脂質(zhì)體混懸液中所含對氧磷酶的總量。

1.2.7 PEG-PON1-LCL的處方優(yōu)化：分別選用不同的藥脂比、磷脂與膽固醇的比例、不同相對分子質(zhì)量的PEG-Chol、不同NaCl濃度按1.2.4方法制備對氧磷酶聚乙二醇化長循環(huán)脂質(zhì)體，以包封率為指標(biāo)考察各處方因素對脂質(zhì)體的影響。選用藥脂比（A）、磷脂與膽固醇的比例（B）、聚乙二醇-膽固醇的用量（C）、不同NaCl濃度（D）為因素，采用正交設(shè)計L9（34）對處方進行優(yōu)化（表1）。

1.2.8 PEG-PON1-LCL的粒度分布：將制備的聚乙二醇化脂質(zhì)體溶液5 ml過0.22 μm的濾膜，取少量溶液滴入激光粒度儀樣品池中，測定聚乙二醇化脂質(zhì)體的粒度分布。

1.2.9 PEG-PON1-LCL初步穩(wěn)定性的考察：按最優(yōu)處方制備6批聚乙二醇化脂質(zhì)體，4℃下放置15 d，測定其包封率及酶活性變化。

2 結(jié)果

2.1 影響對氧磷酶活性測定及活性的因素

考察結(jié)果表明，膽固醇、磷脂、空白脂質(zhì)體、10%Triton對對氧磷酶的活性測定基本沒有影響，二氯甲烷、37℃水?。?0 min）、冰浴超聲等條件對酶活性影響較小，載藥脂質(zhì)體破乳后活性測定是原酶活性的75.08%左右。

2.2 考馬斯亮藍標(biāo)準(zhǔn)曲線

以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)（μg），吸光值（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法進行回歸計算，求得直線方程為y=0.0067x+0.0637，r=0.9994（圖2）。

2.3 處方考察結(jié)果

2.3.1 不同藥脂比對包封率的影響：分別以藥脂比1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，磷脂：膽固醇為4∶1，PEG-Chol為磷脂的5%，薄膜分散法制備脂質(zhì)體。結(jié)果表明，在實驗條件范圍內(nèi)，磷脂的量增加包封率隨之增加（表2）。

2.3.2 磷脂與膽固醇的比例對包封率的影響：固定處方中磷脂的用量，藥脂比，PEG-Chol為磷脂的5%，改變膽固醇的用量，分別以大豆磷脂：膽固醇為2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，無膽固醇，薄膜分散法制備脂質(zhì)體。結(jié)果表明，在實驗條件范圍內(nèi)，隨著膽固醇比例的減少，包封率先增大后減少，有最大值（表3）。

2.3.3 PEG2000-Chol用量對包封率的影響：考察PEG2000-Chol用量對包封率的影響。實驗結(jié)果表明，在實驗范圍內(nèi)，PEG2000-Chol用量為磷脂的5%時，脂質(zhì)體的包封率最大（表4）。

2.3.4 不同NaCl濃度對包封率的影響：固定處方中磷脂的用量，藥脂比，磷脂∶膽固醇為4∶1，PEGChol為磷脂的5%，NaCl的濃度分別為0，5，10，20，40 mmol/L，薄膜分散法制備脂質(zhì)體。結(jié)果表明，在試驗范圍內(nèi)，當(dāng)NaCl的濃度＞20 mmol/L時，脂質(zhì)體的包封率降低（見表5）。

2.3.5 不同緩沖液種類對包封率的影響：固定處方中的磷脂與膽固醇的比例，藥脂比，PEG-Chol用量為磷脂的5%，分別依藥典配制pH 8.0的磷酸鹽緩沖液（PBS）、HEPES緩沖液薄膜分散法制備脂質(zhì)體。結(jié)果表明，在實驗條件范圍內(nèi)，緩沖液的種類對包封率的影響很明顯（表6）。

2.4 正交試驗優(yōu)化處方

結(jié)果表明，各因素對包封率的影響大小次序為A＞D＞B＞C，由此可知，在實驗所選范圍內(nèi)，藥物與脂質(zhì)質(zhì)量比是包封率的主要影響因素，且藥物與磷脂的質(zhì)量比為1∶15（A2）時包封率最高，其次為鹽離子濃度和磷脂與膽固醇的比例，而PEG-Chol用量的影響最?。ū?）。

綜合以上實驗結(jié)果，可以確定薄膜分散法制備的聚乙二醇化脂質(zhì)體的最優(yōu)處方為：磷脂的量為25 mg。磷脂與膽固醇的比例為5∶1。藥脂比為1∶15。選用相對分子量為2000的PEG-Chol，用量為磷脂的5%，pH 8.0酶溶液含NaCl為5.0 mmol/L。用以上處方制備聚乙二醇化脂質(zhì)體，所得脂質(zhì)體的包封率為（87.66±3.46）%。

2.5 PEG-PON1-LCL的粒度分布及Zeta電位

聚乙二醇化脂質(zhì)體的粒度測定結(jié)果（見圖3），其粒度分布呈單峰，粒度分布較窄，平均粒徑為126 nm左右，Zeta電位為-19.35。透射電鏡觀察顯示呈類球形（圖4）。

2.6 PEG-PON1-LCL的初步穩(wěn)定性研究

將聚乙二醇化脂質(zhì)體溶液密封，4℃放置15 d后，聚乙二醇化脂質(zhì)體未出現(xiàn)分層、沉淀現(xiàn)象。藥物包封率和酶活性沒有顯著變化（見表8）。

3 討論

PON1廣泛存在于多種動物體內(nèi)，主要由肝臟生成和分泌，在腦、腎、心、肝和肺臟等多種組織和器官中都有存在，但不同種屬間血清PON1的活性差別很大，在哺乳動物中馬和人血清中PON1的活性低，而以兔血清的PON1活性最高［7］，這也是我們選擇提純兔血清PON1作為研究對象的主要原因。PON1是多任務(wù)蛋白的優(yōu)秀代表［9］，具有水解抑制膽堿脂酶的有機磷和預(yù)防低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的氧化的功能。Furlong實驗室的研究表明大腸桿菌重組人PON1比人天然的PON1對多種底物有更高的催化活性，這種高效的酶水解活性為救治生命和保護健康的催化劑治療提供了希望［10］。

PON1是中分子量的酶蛋白，在體內(nèi)外環(huán)境受多種復(fù)雜的化學(xué)或物理條件影響而易失活，因而有效保持酶的活性十分重要。本實驗對對氧磷酶脂質(zhì)體包裹時，充分考慮了溫度和有機溶劑對酶活性的影響，一是整個實驗條件選擇在37℃以下，且選擇了對酶活性影響不是很大的二氯甲烷作為有機溶劑，同時延長減壓蒸發(fā)時間，減少了痕量有機溶劑的殘留；二是因?qū)ρ趿酌甘撬苄缘鞍?，對水溶性藥物而言，藥物的包封率取決于內(nèi)水體積占總體積的比率，本實驗應(yīng)用了較高的磷脂濃度，有助于增加內(nèi)水相體積所占的比例，從而提高了包封率。水溶性蛋白類藥物包封率很低，但是本實驗對氧磷酶長循環(huán)脂質(zhì)體的包封率較高，接近90%，可能與對氧磷酶的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，其機制有待進一步研究。

本實驗采用瓊脂糖凝膠柱層析方法測定對氧磷酶脂質(zhì)體的包封率，主要根據(jù)含藥脂質(zhì)體和游離對氧磷酶分子大小的不同，滲入凝膠顆粒內(nèi)部的程度亦不同，按照分子由大到小順序流出，該方法操作簡便，測定準(zhǔn)確。

蛋白類藥物與傳統(tǒng)藥物相比，不僅具有用藥劑量小、療效好、毒副作用低等突出優(yōu)點，還具有藥物半衰期短、清除率高、蛋白質(zhì)藥物體內(nèi)外不穩(wěn)定、易受體內(nèi)酶和細菌以及體液的破壞等不同于傳統(tǒng)藥物的一些特性。本實驗進行了脂質(zhì)體的初步穩(wěn)定性考察，以外觀形狀、包封率、酶活性等因素作為考察指標(biāo)，4℃條件下密封放置15 d，以上指標(biāo)均無顯著性改變。PEG修飾長循環(huán)脂質(zhì)體中的組成中，含有親水性聚合物如聚乙二醇的二硬脂酸磷脂酰胺的衍生物等，能夠逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕獲，特別是在體內(nèi)能阻止吞噬細胞對脂質(zhì)體的識別和攝取，而極大延長脂質(zhì)體在血液中循環(huán)時間，從而提高療效，減輕不良反應(yīng)。聚乙二醇化對氧磷酶長循環(huán)脂質(zhì)體的體內(nèi)藥代動力學(xué)有待進一步研究。

本實驗應(yīng)用薄膜分散法制備了對氧磷酶長循環(huán)脂質(zhì)體，其制備工藝簡單，在酶活性穩(wěn)定的前提下，以包封率為指標(biāo)，對各處方因素進行了考察，并應(yīng)用正交設(shè)計進行包封率優(yōu)化，得到了較高的包封率，對氧磷酶長循環(huán)脂質(zhì)體初步穩(wěn)定性良好，酶活性基本穩(wěn)定。

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