鄭偉華，王富蘭，陳 賀

（新疆農(nóng)科院中心實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830000）

品種純度是種子最重要的質(zhì)量指標(biāo)。傳統(tǒng)的品種室內(nèi)純度檢驗(yàn)方法有很大的局限性。種植鑒定需要時(shí)間長(zhǎng)、花費(fèi)大，無(wú)法用于常規(guī)純度檢驗(yàn)。因此，品種純度檢驗(yàn)方法的研究一直是國(guó)內(nèi)外近代種子科學(xué)的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。三十多年來(lái)，電泳譜帶法的應(yīng)用研究表明，它是一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)適用的作物品種純度檢測(cè)技術(shù)。

同工酶的特點(diǎn)是：具有明顯的種屬、組織和發(fā)育階段的特異性，既可作為生理指標(biāo)，又是可靠的遺傳標(biāo)志。植物種子的同工酶譜型是長(zhǎng)期的自然或人工雜交選育的結(jié)果，是基因表達(dá)的產(chǎn)物，記錄了物種在發(fā)育過(guò)程中的血緣關(guān)系，說(shuō)明了種間與品種間深刻的遺傳差異，這種差異不易受環(huán)境條件的影響而改變。因此，同工酶是鑒別品種間遺傳差異的重要標(biāo)志，這在品種真實(shí)性和純度檢驗(yàn)上有著非常重要的意義。

為系統(tǒng)研究甜瓜種子蛋白多態(tài)性與品種純度和真實(shí)性鑒定的關(guān)系，我們選用了4種具有一定代表性的同工酶進(jìn)行電泳鑒定。其中，過(guò)氧化物同工酶和乙醇脫氫酶同工酶屬于氧化還原酶類(lèi)，這類(lèi)酶可以催化有機(jī)體的各種氧化還原反應(yīng)；酯酶同工酶和酸性磷酸酯酶同工酶屬于水解酶類(lèi)，可以催化復(fù)雜有機(jī)物加水分解為較簡(jiǎn)單的化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

選用生產(chǎn)推廣種植的雜交伽師瓜1號(hào)、雪里紅、新組合9808的雜交種及其父母本共9個(gè)材料作為研究對(duì)象。所用材料均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所提供，所有種子批均進(jìn)行了系譜鑒定，種子的來(lái)源和純度經(jīng)過(guò)確認(rèn)。

1.2 方法

1.2.1 樣品提?。喝‰s交伽師瓜1號(hào)、雪里紅、組合9808的雜交種及其父母本和新紅心脆的雜交種種子的欲測(cè)種子剝殼后放入小研缽中，冰浴研磨再轉(zhuǎn)入離心管中，每管分別加入80 μL的樣品提取液后浸提過(guò)夜，9 000 r/min離心15 min，取其上清液進(jìn)行電泳分析。

（1）提取液 A：蔗糖 20 g、溴酚藍(lán) 0.125 g，定容至50 mL。

（2）提取液B(即電極緩沖液)：甘氨酸 7.2 g、Tris1.5 g，調(diào)pH值為8.3后定容至250 mL。

（3）樣品提取液：使用時(shí)取提取液 A10 mL、提取液 B2 mL、水8 mL混勻備用。

1.2.2 電泳方法：采用垂直板不連續(xù)系統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，下層分離膠濃度為10%，上層濃縮膠濃度為5%。膠板厚度為1.0 mm，樣品篦子為15齡，加樣量為每孔15μL。凝膠制備時(shí)，取適量凝膠儲(chǔ)備液，加入數(shù)滴新配置的10%過(guò)硫酸銨和適量的TEMED，快速混勻，倒入制膠室，插好樣品梳。膠體凝固后將膠模放入電泳槽，并用適當(dāng)體積的電極緩沖液注入電泳槽，取樣品上清液15～20 μL點(diǎn)樣。電泳在4℃下進(jìn)行，電泳電壓穩(wěn)壓80～150 V，電泳時(shí)間2～4 h。

1.2.3 染色方法：酯酶同工酶染色采用醋酸-α-萘酯堅(jiān)牢藍(lán)RR鹽法，過(guò)氧化物同工酶染色采用醋酸聯(lián)苯胺法，乙醇脫氫酶同工酶染色采用輔酶ⅠNBT PMS染色法。電泳結(jié)束后剝下膠板用自來(lái)水沖洗兩次，倒入50～100 mL染色液。在37℃溫箱內(nèi)保溫40 min，每隔幾分鐘搖動(dòng)一次，待膠板呈現(xiàn)出清晰的深藍(lán)色譜帶為止。染色后的膠片用乙醇凝膠洗滌液（乙醇100 mL、乙酸400 mL、甘油200 mL、水800 mL）洗凈。膠片可照相、制成干膠或用BIO RAD Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)掃描將圖譜記錄在磁盤(pán)中，以備分析鑒定。

1.3 儀器

電泳儀為BIO RAD POWER PAC1000型。電泳槽是Mini PROTEAN 3 Cell型。BIO RAD Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 電泳圖譜的分析

從圖1、圖2可以看出，雜交伽師瓜1號(hào)、雪里紅、組合9818的雜交種及其父母本種子和新紅心脆的雜交種種子的酯酶同工酶均有Rf值為0.11、0.21、0.30、0.47、0.63、0.71、0.84、0.90、0.96 的 9 條帶 (見(jiàn)圖 1)，不同品種之間在部分譜帶的強(qiáng)弱上有一定的差異。

乙醇脫氫酶同工酶均有Rf值為0.74的1條帶(見(jiàn)圖2)，其中，雜交伽師瓜1號(hào)的雜交種種子還有一條Rf值為0.82的帶。

過(guò)氧化物同工酶、酸性磷酸酯酶同工酶均無(wú)譜帶。

2.2 討論

在同一條件下重復(fù)分析結(jié)果顯示,甜瓜種子中酯酶同工酶的多態(tài)性最多，但不同的同工酶圖譜間均無(wú)特異性譜帶。這是因?yàn)槟壳疤鸸嫌N中使用的親本材料親緣關(guān)系很近，它們之間即使存在差異也是細(xì)微、不易分辨的。本試驗(yàn)結(jié)果再次證明，電泳方法的分辨率較低，不能分辨出這種差異。因此，種子同工酶電泳法不適于鑒定甜瓜父母本和雜交種的品種純度。應(yīng)在今后的工作中探討利用其他方法例如高效液相色譜法、分子生物學(xué)方法等鑒定甜瓜品種真實(shí)性與純度的可能性。

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