陳 櫻 孟 東 孫 培 王寶利 鄧為民 姚 智

糖尿病細菌感染一直是困擾糖尿病患者和廣大醫(yī)生的難題，雖然有大量廣譜抗生素應(yīng)用于臨床，但感染的發(fā)生率仍呈增高的趨勢，感染引起的糖尿病患者死亡仍占較高比例[1]。研究表明，糖尿病高血糖可以影響單核細胞的趨化、黏附作用[2-3]，促進細胞調(diào)亡。本研究旨在探討高糖狀態(tài)下，金黃色葡萄球菌（金葡菌）對THP-1人單核細胞表達誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和白細胞介素（IL）-1β的影響，以期從細胞免疫學(xué)角度了解糖尿病患者感染的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）單核細胞和培養(yǎng)試劑：人單核細胞株THP-1購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院。RPMI1640培養(yǎng)液為美國GIBCO公司產(chǎn)品，胎牛血清（FBS）為美國Hyclone公司產(chǎn)品。（2）菌種和調(diào)理素：金葡菌標準菌26001株（天津市金章科技發(fā)展有限公司），普通培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18 h。挑取單個菌落，用生理鹽水將標準菌株制成約1.5×108CFU/mL（CFU：集落形成單位）細菌懸液，使用新鮮人混合血清調(diào)理1.5 h備用。（3）iNOS、IL-1β表達測定用試劑：TRIzol總RNA分離試劑購自美國Promega公司；RT-PCR試劑盒為美國LIFE TECHNOLOGIES公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 PRMI1640培基體外培養(yǎng)單核細胞株THP-1，采用 2×2析因分析實驗設(shè)計，以高糖（A）、細菌（B）2個因素，每個因素2個水平交叉分為4組，分別為對照組（5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（25.0 mmol/L葡萄糖）、細菌組（1.5×107CFU/mL金葡菌+5.5 mmol/L葡萄糖）和高糖細菌組（1.5×107CFU/mL金葡菌+25.0 mmol/L葡萄糖）。分組細胞首先以上述2種濃度的葡萄糖培養(yǎng)72 h，再移至六孔培養(yǎng)板，同時細菌組和高糖細菌組加入金葡菌，調(diào)整細胞/細菌比例為1∶15，置37℃，270 r/min振蕩孵育1.5 h。測定iNOS和IL-1β的表達情況。

1.2.2 iNOS表達測定 用TRIzol總RNA分離試劑提取細胞RNA，用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（SQ-RT-PCR）法檢測iNOS表達。引物：上游5′-CCAGCTAGCCAAAGTCACCA T-3′，下游 5′-GTCTCGGAGCCATACAGGATT-3′，擴增片段長 354 bp；GAPDH: 上游 5′-AGTCCACTGGCGTCTTCAC-3′，下游 5′-TGATCTTGAGGCTGTTGTC-3′，擴增片段長 240 bp。iNOS表達產(chǎn)物電泳結(jié)果采用GeneSnap凝膠圖像采集分析系統(tǒng)（SynGene公司產(chǎn)品）拍照，對凝膠中的特異性條帶進行掃描，用凝膠圖像分析軟件分析，測定其相對光密度，計算各因子與GAPDH的光密度比值作為半定量指標。iNOS基因的PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，72℃10 min。

1.2.3 IL-1β 表達測定 IL-1β 引物：上游5′-CATCCAGCT TCAAATCTCAC-3′，下游 5′-ACCACTTGTTGGCTTATGTT-3′，擴增片段長333 bp。IL-1β基因PCR擴增條件：94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共35個循環(huán)，72℃10 min。GAPDH和反應(yīng)產(chǎn)物分析同1.2.2。

2 結(jié)果

2.1 單變量多因素方差分析結(jié)果 高糖和細菌及兩者交互效應(yīng)均影響THP-1人單核細胞表達iNOS和 IL-1β，見表1、2。

2.2 單因素方差分析結(jié)果 4組組間iNOS、IL-1β表達水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F分別為49.87、44.63，均P<0.01）。組間的多重比較結(jié)果顯示，高糖組與對照組相比細胞表達iNOS和IL-1β均減弱；細菌組與對照組比較iNOS和IL-1β表達均增高；與高糖組比較，高糖細菌組IL-1β表達增高，iNOS表達變化不明顯，見表1、3。

表1 金葡菌對高糖狀態(tài)下THP-1人單核細胞表達iNOS和 IL-1β 的影響 （n=5，±s）

表1 金葡菌對高糖狀態(tài)下THP-1人單核細胞表達iNOS和 IL-1β 的影響 （n=5，±s）

分組對照組高糖組細菌組高糖細菌組iNOS mRNA/GAPDH 0.645±0.157 0.295±0.085 1.328±0.216 0.377±0.089 IL-1β mRNA/GAPDH 1.154±0.150 0.450±0.082 1.358±0.161 1.048±0.147

表2 多因素方差分析結(jié)果

表3 單因素方差分析組間多重比較的q值

3 討論

嚴重感染是糖尿病患者死亡的重要原因之一[4]。糖尿病患者由于血糖升高，蛋白代謝紊亂，免疫功能低下，抵抗力降低等因素，極易造成各類感染，其中呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、膽道及皮膚軟組織的感染率分別是非糖尿病患者的2～5倍[1]。且糖尿病患者在高血糖狀態(tài)下，感染往往不易控制[5]。因此，研究高糖狀態(tài)下免疫細胞的功能有助于了解糖尿病感染的機制。

iNOS是單核細胞產(chǎn)生一氧化氮（NO）的主要限速酶。NO是體內(nèi)重要的生物活性分子和信號分子。正常情況下，單核細胞釋放的NO具有重要的保護機體的作用。筆者先前研究表明，高糖可以抑制內(nèi)皮細胞表達內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）[6]。IL-1β是一個多效性促炎細胞因子，可由巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞等產(chǎn)生，能促進內(nèi)皮細胞合成、表達細胞間黏附分子（ICAM）-1和血管細胞黏附分子（VCAM）-1，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞釋放血小板衍生生長因子（PDGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等促有絲分裂素，同時促進多形核白細胞與內(nèi)皮細胞黏附并協(xié)同其刺激內(nèi)皮細胞合成和釋放PDGF和bFGF，誘導(dǎo)細胞外基質(zhì)蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)干擾素（IFN）γ產(chǎn)量等[7]。IL-1β的表達在感染損傷后的炎癥反應(yīng)和平滑肌細胞激活、移行、增殖的各個階段都起著很重要的作用。

細菌能夠刺激細胞產(chǎn)生促炎反應(yīng)因子IL-1β和TNF-α，并減弱吞噬細胞活性[8]。細菌脂多糖可以通過激活caspase-1誘導(dǎo)THP-1細胞釋放IL-1β[9]。金黃色葡萄球菌是糖尿病感染常見致病菌，金葡溶血素α和殺白細胞素可損傷或殺死單核巨噬細胞和粒細胞。本研究顯示，高糖和金葡菌及二者交互效應(yīng)均可影響THP-1人單核細胞表達iNOS和IL-1β。高糖使iNOS和IL-1β表達減弱，細菌感染作為獨立因素可使兩指標表達增強；但高糖和細菌感染同時存在時，僅IL-1β表達增強，iNOS表達變化不顯著，提示糖尿病感染患者免疫功能降低與高糖狀態(tài)下免疫細胞表達iNOS和IL-1β減弱有關(guān)。因此，從改善糖尿病患者細胞免疫功能的角度來講，控制患者的血糖就顯得尤為重要。同時，改善患者免疫細胞功能在一定程度上能控制和減少糖尿病感染的發(fā)生。

[1]許曼音.糖尿病學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2003:533-541.

[2]Cipollone F,Chiarelli F,Iezzi A,et al.Relationship between reduced BCL-2 expression in circulating mononuclear cells and early nephropathy in type 1 diabetes[J].Int J Immunopathol Pharmacol,2005，18(4):625.

[3]Vogl-Willis CA,Edwards IJ.High glucose-induced alterations in subendothelial matrix perlecan leads to increased monocyte binding[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24(5):858.

[4]賀東風，吳松華.糖尿病感染因素分析[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2003，15（8）：406.

[5]張華平，曾奕明，葉虹虹.糖尿病并發(fā)感染及其危險因素分析[J].中國綜合臨床,2002，18（9）：809.

[6]孟東，陳櫻，劉德敏，等.高糖對人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡及bclx、bax 和 eNOS 表達的影響[J].天津醫(yī)藥,2005，33（6）：335-337.

[7]Raices RM,Kannan Y,Sarkar A.A synergistic role for IL-1beta and TNFalpha in monocyte-derived IFNgamma inducing activity[J].Cytokine，2008,44(2):234-241.

[8]Ciabattini A，Cuppone AM，Pulimeno R，et al.Stimulation of human monocytes with the gram-positive vaccine vector Streptococcus gordonii[J].Clin Vaccine Immunol,2006,13(9):1037.

[9]Kuijk LM,Mandey SH,Schellens I，et al.Statin synergizes with LPS to induce IL-1beta release by THP-1 cells through activation of caspase-1[J].Mol Immunol，2008,45(8):2158-2165.