劉雅麗，費永俊

(長江大學園藝園林學院，湖北 荊州430025)

曾會明

(北京林業(yè)大學草坪研究所，北京100083)

影響日本結縷草成熟種子愈傷組織誘導率和出愈時間的相關因子研究

劉雅麗，費永俊

(長江大學園藝園林學院，湖北 荊州430025)

曾會明

(北京林業(yè)大學草坪研究所，北京100083)

誘導率和出愈時間是愈傷組織誘導過程中的關鍵參數(shù)。本研究以日本結縷草(Zoysiajaponica)成熟種子為材料，研究了研磨、接種方式和浸泡等因素對愈傷組織誘導率和出愈時間的影響。結果顯示，在MS + 2,4-D 5 mg/L + L-Pro 500 mg/L + 蔗糖30 g/L + 瓊脂7 g/L培養(yǎng)基上，pH5.8時，研磨處理的結縷草種子愈傷組織誘導率遠高于未研磨處理的；隨機接種方式的愈傷組織誘導率高于機械接種方式的；浸泡72h后愈傷組織誘導率高。結果表明，在研磨情況下，日本結縷草種子浸泡72 h后，采取隨機接種方式，培養(yǎng)第5～7 d即出現(xiàn)愈傷組織，第9～11 d愈傷組織發(fā)生達到高峰期，第14 d便可進行繼代培養(yǎng)，愈傷組織誘導率達95.6%。

日本結縷草(Zoysiajaponica)；愈傷組織；誘導率；出愈時間

結縷草(Zoysia)屬禾本科畫眉草亞科結縷草屬，廣泛分布于亞洲和大洋洲的熱帶、亞熱帶甚至溫帶地區(qū)，是當今世界上公認的優(yōu)良暖季型草坪草種[1，2]，是唯一的國產草坪草，也是我國草坪植物中栽培最早、應用最多的草種之一。日本結縷草(Zoysiajaponica)具有耐踐踏、富有彈性、抗旱、低矮致密、耐修剪、耐高溫、對氣候和土壤適應性廣等許多的優(yōu)良性狀，在城市草坪和運動草坪中得到了廣泛的應用[3，4]。

國內外學者對日本結縷草愈傷組織的誘導、再生分化體系進行了一些研究[5～11]。國內研究報道的結縷草成熟種子愈傷組織誘導率在34.2%～57.3%之間[5～7]。由于日本結縷草的誘導率較低、出愈時間較長[5～10]，高效組織培養(yǎng)體系和轉化體系建立困難。本研究以日本結縷草成熟種子為外植體，研究浸泡、研磨和接種方式等因素對愈傷組織誘導的影響，以期為優(yōu)化日本結縷草組織培養(yǎng)體系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

日本結縷草‘Zenith’品種種子由美國TMI公司(Turf Merchants，Inc)惠贈。

1.2 材料消毒

種子置于50 mL離心管中，加入1～2滴Tween-20和35 mL次氯酸鈉原液(有效氯gt;10.0%)，磁力攪拌器上攪拌1 h，無菌水沖洗5～6次，40 mL無菌水攪拌0.5 h，無菌水沖洗5～6次，加入20 mL無菌水置于4 ℃冰箱浸泡2～3 d。在超凈工作臺內用無菌水沖洗2次，加入35 mL次氯酸鈉原液，再加去離子水至50 mL，攪拌20 min，無菌水沖洗5～6次，備用。

1.3 研磨處理

將經過消毒的種子用無菌水清洗3～5次，在接種前將種子在無菌研缽中研磨5 min。

1.4 浸泡處理

對無菌處理的結縷草成熟種子分別浸泡48 h、60 h和72 h，研磨后接種。每種處理5個重復，第3 d、5 d、7 d、14 d統(tǒng)計愈傷組織誘導率(其中第3 d的數(shù)據(jù)為發(fā)芽率)。

1.5 接種方式

機械接種：將種子一粒一粒排列接種于培養(yǎng)基上。每皿種子數(shù)為100粒。

隨機接種：將隨機所取的種子放置于無菌濾紙上，晃動濾紙，使種子自然分散，將濾紙倒扣于培養(yǎng)基上，揭去濾紙。每皿種子數(shù)100粒。

1.6 愈傷組織的誘導

將消毒處理過的種子接種在MS5+L-Pro培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基為MS + 2,4-D 5 mg/L + L-Pro 500 mg/L + 蔗糖30 g/L + 瓊脂 7 g/L，pH5.8，愈傷組織繼代培養(yǎng)基為MSD(MS無機鹽 + B5有機物)+ 2,4-D 1 mg/L + L-Pro 500 mg/L + 蔗糖30 g/L + 瓊脂7 g/L，pH5.8。28 ℃黑暗培養(yǎng)，待種子萌發(fā)的芽基部出現(xiàn)白色的愈傷小塊后，除去萌發(fā)的芽體，以促進愈傷小塊的生長。接種15 d后對誘導出的愈傷進行繼代培養(yǎng)。

2 結果與分析

2.1 研磨處理對日本結縷草種愈傷組織誘導率的影響

注:利用LSD法進行多重比較。同行標有不同大寫字母者表示組間差異極顯著，標有不同小寫字母者表示組間差異顯著。圖2、圖3同。圖1 研磨處理對結縷草種愈傷組織誘導率的影響Figure 1 Effect of grinding on the induction of callus

將研磨和未研磨的結縷草種子采用機械接種方式接種至培養(yǎng)基上。接種第3 d種子胚處出現(xiàn)芽點，研磨處理的種子發(fā)芽率達到36.4%，而未研磨的發(fā)芽率僅1.4%；接種第5 d種子芽基部有白色突起，研磨后種子誘導率達到42.6%，而未研磨的僅為2.2%；接種第7 d白色突起形成愈傷組織，第9 d愈傷組織發(fā)生達到高峰期，接種第14 d即可對愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，此時研磨后種子的愈傷組織誘導率高達64.6%，未研磨的為11.4%(圖1)。隨著誘導時間延長，愈傷組織誘導率逐漸增加。在研磨處理下，第3 d、第5 d、第7 d和第14 d之間差異極顯著；而未研磨處理的結縷草種子愈傷組織誘導率在第3 d、第5 d、第7 d之間差異不顯著，第14 d與第3 d、第5 d、第7 d差異極顯著(表1)。結果表明，研磨能顯著提高日本結縷草愈傷組織誘導率。根據(jù)這一結果，以下實驗均在研磨后進行。

表1 在不同處理下不同時間結縷草種子愈傷組織誘導率的變化Table 1 The change of callus induction rate at different time under different treatments %

注：利用Duncan法進行多重比較。同列標有不同大寫字母者表示組間差異極顯著，標有不同小寫字母者表示組間差異顯著。

2.2 接種方式對日本結縷草種愈傷組織誘導率的影響

將研磨后日本結縷草種子采取機械接種和隨機接種2種接種方式接種于培養(yǎng)基上，統(tǒng)計愈傷組織誘導率。由表1可知，隨著誘導時間延長，隨機接種的愈傷組織誘導率逐漸增加，并且第3 d、第5 d、第7 d和第14 d之間差異極顯著；但機械接種是愈傷組織誘導率在第3 d、第5 d、第7 d之間差異不顯著，而第14 d與第3 d、第5 d、第7 d差異極顯著。而且由圖2可以看出，接種第3 d、第5 d和第14 d，隨機接種愈傷組織誘導率極顯著高于機械接種的。根據(jù)這一結果，以下實驗采取隨機接種。

圖2 不同接種方式對結縷草種愈傷組織誘導率的影響Figure 2 Effect of transferring ways on the induction of callus

2.3 浸泡處理結縷草種子對愈傷組織誘導率的影響

圖3 不同浸泡處理對結縷草種愈傷組織誘導率的影響Figure 3 Effect of immersing on the induction of callus

由表1可知，浸泡48 h和浸泡60 h的愈傷組織誘導率在第3 d、第5 d、第7 d和第14 d差異極顯著，而浸泡72 h的在第3 d、第5 d差異顯著，第7 d和與14 d差異不顯著，結果表明，浸泡后結縷草種子愈傷組織誘導率隨著誘導時間的延長而增加。由圖3則可以看出，接種后第3 d、第5 d，浸泡48 h與浸泡60 h的愈傷組織誘導率差異不顯著，但顯著低于浸泡72 h的；接種第7 d、第14 d，3種浸泡時間愈傷組織誘導率差異極顯著，而且浸泡72 h的愈傷組織誘導率最高。結果表明，結縷草種子研磨過的種子浸泡72 h后采用隨機接種方式接種，愈傷組織誘導率最高。

3 小結與討論

誘導率和出愈時間是單子葉植物遺傳轉化體系中的重要因素，本研究通過研磨、浸泡和接種方式等方式處理，縮短了出愈時間，提高了誘導率。

(1) 自1987年Al-Khayri等[11]以日本結縷草成熟種子建立植株再生體系后，不斷有以日本結縷草莖尖、幼穗、節(jié)段為外植體建立植株再生體系的報道[6,12～14]。張俊衛(wèi)等[7]認為誘導結縷草愈傷組織最佳2,4-D濃度為1～2 mg/L，愈傷組織誘導率最高可達57.3%。齊春輝等[5]則認為在培養(yǎng)基中加入營養(yǎng)物質可提高愈傷組織誘導率。但在本研究中，2,4-D濃度為5 mg/L的愈傷組織最高可達95.6%，明顯高于張俊衛(wèi)[7]、李瑞芬等[6]的結果，可能是因為本研究采用的物理手段打破了結縷草種的休眠，促進和誘發(fā)了結縷草愈傷組織的形成。

(2)研究表明，結縷草愈傷組織誘導在培養(yǎng)15～18 d后才觀察到白色突起，20～25 d愈傷組織達到高峰期，30～40 d才能進行愈傷組織誘導率統(tǒng)計和繼代[15～17]。而本研究表明，培養(yǎng)3 d觀察到種子胚處出現(xiàn)芽點，培養(yǎng)5 d即可觀察到種子芽基部有白色突起，7 d有愈傷組織形成，9 d愈傷組織達到高峰期，14 d即可對愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，大大縮短了出愈時間。

(3)本研究表明，研磨后的愈傷組織誘導率遠遠高于未研磨處理?？赡苁怯捎谌毡窘Y縷草種子表層有較厚的保護層，研磨處理造成種子表層的保護層的破裂，打破了種子休眠，激發(fā)種子活性，提高種子的發(fā)芽率和愈傷組織誘導率。研磨處理時應以種子種皮磨損為宜。研磨程度過重，種子內部受損，發(fā)芽率自然不高，研磨程度過輕，種子外皮的蠟質保護層并沒有受到破壞，種子發(fā)芽率也不高。

(4)研究表明，用水浸泡處理和綜合處理的方法可以快速有效地促進種子發(fā)芽。方文娟[18]在對日本結縷草‘Zenith’品種浸泡處理時發(fā)現(xiàn)，該品種的最佳浸泡時間為2～3 d，愈傷組織誘導率增長了1.26倍，但隨著浸泡時間再延長，種子生活力下降，愈傷組織誘導率也相應下降。本研究中浸泡72 h的日本結縷草種愈傷組織誘導率高于浸泡48 h和60 h，與方文娟的結果類似。

(5)在采用機械接種和隨機接種2種接種方式時，試驗結果差異極顯著，原因有待進一步研究。

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2009-11-19

國家”863”計劃(2006AA10Z132)；北京林業(yè)大學博士點基金(20070417)

劉雅麗(1985-)，女，湖北天門人，碩士研究生，研究方向為草坪草育種.

費永俊，E-mail:fyj2010@163.com

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.01.016

Q813.1

A

1673-1409(2010)01-S063-04