林麗超,陳建紅,黃得純,張濟(jì)培,司興奎

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,廣東佛山528231)

鴨疫里默氏菌病是侵害雛鴨、雛鵝及雛火雞等多種禽類的一種急性或慢性敗血性傳染病,其病變特征為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎。本病在我國許多省區(qū)均有發(fā)生,已成為危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病。目前,藥物預(yù)防雖有一定效果,但由于細(xì)菌耐藥性的不斷增強(qiáng),使純粹依賴藥物防治有一定難度;研制安全、有效的疫苗是控制鴨疫里默氏菌病的另一有效途徑。本研究擬對(duì)雛鴨接種不同佐劑及不同保存時(shí)間的鴨疫里默氏菌滅活疫苗,并經(jīng)攻毒作免疫保護(hù)比較,以探討鴨疫里默氏菌滅活疫苗的有效佐劑及有效保存時(shí)間,為提高本病的免疫效果提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株和試驗(yàn)動(dòng)物 鴨疫里默氏菌菌株來源于廣東三水,由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供。試驗(yàn)動(dòng)物為1日齡健康仙湖肉鴨,由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院科研禽場提供。

1.2 疫苗制備 將鴨疫里默氏菌(RA)菌種接種于血液瓊脂平板培養(yǎng)基,于37℃燭缸中培養(yǎng)24h,選擇單個(gè)菌落。將RA純培養(yǎng)物接種于血清營養(yǎng)肉湯中于37℃恒溫增菌培養(yǎng)24h,作RA疫苗基礎(chǔ)菌液。加入0.3%甲醛,37℃滅活24h。

每月定期用3種佐劑制備RA滅活疫苗：(1)將RA滅活菌液與一定比例吐溫-80混合后制成水相,再與一定比例白油乳化成油乳劑滅活疫苗。(2)將RA滅活菌液按適當(dāng)比例加入蜂膠提取液(蜂膠10mg/mL),充分混勻成蜂膠滅活疫苗。(3)將RA滅活菌液與鋁膠佐劑按一定比例混勻成RA鋁膠滅活疫苗[1-2]。

1.3 滅活疫苗安全性試驗(yàn) 滅活疫苗接種于血液瓊脂平板培養(yǎng)基,48h后觀察,無細(xì)菌生長為合格。15只7日齡健康仙湖肉鴨,隨機(jī)均分3組,1組胸部皮下注射RA油乳劑滅活疫苗2mL/只,2組胸部皮下注射RA蜂膠滅活疫苗2mL/只,3組胸部皮下注射RA鋁膠滅活疫苗2mL/只,連續(xù)觀察10d。

1.4 滅活疫苗保存期試驗(yàn)

1.4.1 保存處理 將先后制備的RA油乳劑滅活疫苗、蜂膠滅活疫苗、鋁膠滅活疫苗分別分裝,在4℃冰箱保存。抽取保存 90、150、180、210、240、270d的各種滅活疫苗各1瓶進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.2 動(dòng)物分組和免疫攻毒試驗(yàn) 將140只1日齡健康鴨隨機(jī)分成20組,每組7只。1～18組鴨在7日齡按表1經(jīng)胸部皮下注射不同疫苗作首免(0.4mL/只),14日齡作 2免(0.6mL/只)。19組為非免疫攻毒對(duì)照組,20組為健康對(duì)照組,不作免疫接種。21日齡對(duì)1～19組鴨用同源菌株菌液(菌液活菌數(shù)約為1.8×108CFU/mL)通過足墊部注射進(jìn)行攻毒;注射劑量0.5mL/只。第20組不攻毒作健康對(duì)照。攻毒后連續(xù)觀察10d,統(tǒng)計(jì)存活率,并對(duì)死亡鴨和存活鴨剖檢其病變,對(duì)可疑者作細(xì)菌分離鑒定。

表1 試驗(yàn)分組與處理

2 結(jié)果與分析

2.1 滅活疫苗安全性檢驗(yàn)結(jié)果 接種3種滅活疫苗后,雛鴨1d內(nèi)出現(xiàn)精神委頓,食欲下降,1d后精神、食欲恢復(fù)正常,試驗(yàn)結(jié)束未發(fā)現(xiàn)死亡病例,剖檢雛鴨無肉眼可見的病變,表明 3種滅活疫苗均具有良好的安全性。但油乳劑滅活疫苗組鴨,注射部位的肌肉可見一綠豆大小的硬塊。蜂膠和鋁膠滅活疫苗組鴨注射部位未見紅腫與異物。

2.2 RA滅活疫苗免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 從表2可見,油乳劑滅活疫苗隨保存時(shí)間的延長,免疫保護(hù)率保持穩(wěn)定有逐漸上升的趨勢(shì),蜂膠滅活疫苗和鋁膠滅活疫苗隨保存時(shí)間的延長,免疫保護(hù)率有逐漸下降的趨勢(shì)。

同一保存時(shí)間不同佐劑疫苗比較,油乳劑滅活疫苗免疫保護(hù)率同比均優(yōu)于蜂膠滅活疫苗和鋁膠滅活疫苗。相同佐劑疫苗不同保存時(shí)間比較,油乳劑滅活疫苗免疫保護(hù)率比較穩(wěn)定,從90d到270d保存期疫苗免疫保護(hù)率維持在71.4%～100%之間,同比優(yōu)于蜂膠滅活疫苗和鋁膠滅活疫苗,保存270d的RA油乳劑滅活疫苗免疫保護(hù)率仍可維持在100%。不同保存期的蜂膠滅活疫苗,免疫保護(hù)率波動(dòng)于42.9%～71.4%之間。鋁膠滅活疫苗的免疫效果基本與保存時(shí)間成反比關(guān)系,保存90d的疫苗免疫保護(hù)率為71.4%,保存240d的疫苗免疫保護(hù)率為33.3%,例外的是保存到270d的疫苗免疫保護(hù)率反而有所上升,為57.1%。

表2 3種不同佐劑不同保存時(shí)間免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

2.3 攻毒后剖檢結(jié)果 對(duì)攻毒死亡鴨剖檢可見,多數(shù)病死鴨發(fā)生纖維素性心包炎,心包積液,嚴(yán)重者心包膜與胸腔內(nèi)膜粘連;肝周炎,表面被裹淡黃色的纖維素性滲出物;其病變特征與鴨疫里默氏菌病典型病變相符。

3 討論

3.1 不同佐劑RA滅活疫苗免疫效果的比較 油佐劑是目前動(dòng)物滅活疫苗中應(yīng)用最為廣泛、效果較為可靠的佐劑之一,可刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體。蜂膠內(nèi)含多種生物活性物質(zhì),配合抗原注入機(jī)體,可增強(qiáng)補(bǔ)體功能、增強(qiáng)免疫功能細(xì)胞及吞噬細(xì)胞數(shù)量,促進(jìn)抗體產(chǎn)生,從而增強(qiáng)免疫功能。但蜂膠佐劑的劑型較多,制法不一,并且不同工藝制備的蜂膠佐劑,對(duì)免疫作用的影響程度也不一樣[3]。鋁膠佐劑主要誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答,不能明顯地誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答。鋁膠佐劑在注射部位緩慢釋放抗原物質(zhì)的效應(yīng)較弱,因而佐劑活性較低,并且對(duì)許多抗原的免疫促進(jìn)作用都不明顯。由試驗(yàn)結(jié)果可見,RA油乳劑滅活疫苗的免疫保護(hù)率效果最好,其次是蜂膠滅活疫苗,最差的是鋁膠滅活疫苗。在270d的保存期內(nèi)6次免疫試驗(yàn),任何一次油乳劑滅活疫苗的免疫保護(hù)率都高于蜂膠滅活疫苗和鋁膠滅活疫苗,同比,蜂膠滅活疫苗稍優(yōu)于鋁膠滅活疫苗。這一結(jié)果與3種佐劑的基本特性相吻合。

3.2 相同佐劑不同保存時(shí)間RA滅活疫苗免疫效果的比較 RA油乳劑滅活疫苗從90d至270d不同保存時(shí)間的疫苗免疫保護(hù)率在71.4%～100%之間;疫苗保存270d高達(dá)100%,表明油乳劑滅活疫苗的有效保存時(shí)間最少可達(dá)270d;但90d、150d和240d疫苗免疫保護(hù)率出現(xiàn)波動(dòng),其原因可能由于不同保存期RA油乳劑滅活疫苗制備過程中存在誤差,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體水平存在差異。蜂膠滅活疫苗免疫保護(hù)率基本隨著保存時(shí)間的增長,表現(xiàn)下降趨勢(shì)(42.9%～71.4%)。鋁膠滅活疫苗免疫效果基本與保存時(shí)間成反比關(guān)系,下降趨勢(shì)比蜂膠滅活疫苗更明顯(33.3%～71.4%),提示 RA油乳劑滅活疫苗保存穩(wěn)定性較好,蜂膠滅活疫苗和鋁膠滅活疫苗保存穩(wěn)定性較差。

3.3 免疫注射局部反應(yīng) 經(jīng)試驗(yàn)觀察,注射油乳劑滅活疫苗組鴨,注射部位的肌肉可見一綠豆大小的硬塊,硬塊通常隨生長增長而消退,蜂膠和鋁膠滅活疫苗組鴨注射部位未見紅腫。由此可見3種RA滅活疫苗無明顯副反應(yīng)。

3.4 依據(jù)3種不同佐劑滅活疫苗免疫保護(hù)率的高低及其對(duì)雛鴨的副作用大小,建議廣大養(yǎng)殖戶選用油乳滅活疫苗對(duì)鴨疫里默氏菌病進(jìn)行免疫防治。

[1]姜平.獸醫(yī)生物制品學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2003：71-72.

[2]高福,郭玉璞.小鴨傳染性漿膜炎疫苗的研究[J].中國獸醫(yī)雜志,1987,13(6)：51-53.

[3]齊雪峰,楊曉燕,羅薇,等.幾種新型佐劑的研究近況及存在問題[J].中國家禽,2003,25(22)：44-45.