林麗超,陳建紅,黃得純,張濟(jì)培,司興奎

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,廣東佛山528231)

鴨疫里默氏菌病是侵害雛鴨、雛鵝及雛火雞等多種禽類的一種急性或慢性敗血性傳染病,其病變特征為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎。本病在我國許多省區(qū)均有發(fā)生,已成為危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病。目前,藥物預(yù)防雖有一定效果,但由于細(xì)菌耐藥性的不斷增強(qiáng),使純粹依賴藥物防治有一定難度;研制安全、有效的疫苗是控制鴨疫里默氏菌病的另一有效途徑。本研究擬對雛鴨接種不同佐劑及不同保存時間的鴨疫里默氏菌滅活疫苗,并經(jīng)攻毒作免疫保護(hù)比較,以探討鴨疫里默氏菌滅活疫苗的有效佐劑及有效保存時間,為提高本病的免疫效果提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株和試驗(yàn)動物 鴨疫里默氏菌菌株來源于廣東三水,由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供。試驗(yàn)動物為1日齡健康仙湖肉鴨,由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院科研禽場提供。

1.2 疫苗制備 將鴨疫里默氏菌(RA)菌種接種于血液瓊脂平板培養(yǎng)基,于37℃燭缸中培養(yǎng)24h,選擇單個菌落。將RA純培養(yǎng)物接種于血清營養(yǎng)肉湯中于37℃恒溫增菌培養(yǎng)24h,作RA疫苗基礎(chǔ)菌液。加入0.3%甲醛,37℃滅活24h。

每月定期用3種佐劑制備RA滅活疫苗：(1)將RA滅活菌液與一定比例吐溫-80混合后制成水相,再與一定比例白油乳化成油乳劑滅活疫苗。(2)將RA滅活菌液按適當(dāng)比例加入蜂膠提取液(蜂膠10mg/mL),充分混勻成蜂膠滅活疫苗。(3)將RA滅活菌液與鋁膠佐劑按一定比例混勻成RA鋁膠滅活疫苗[1-2]。

1.3 滅活疫苗安全性試驗(yàn) 滅活疫苗接種于血液瓊脂平板培養(yǎng)基,48h后觀察,無細(xì)菌生長為合格。15只7日齡健康仙湖肉鴨,隨機(jī)均分3組,1組胸部皮下注射RA油乳劑滅活疫苗2mL/只,2組胸部皮下注射RA蜂膠滅活疫苗2mL/只,3組胸部皮下注射RA鋁膠滅活疫苗2mL/只,連續(xù)觀察10d。

1.4 滅活疫苗保存期試驗(yàn)

1.4.1 保存處理 將先后制備的RA油乳劑滅活疫苗、蜂膠滅活疫苗、鋁膠滅活疫苗分別分裝,在4℃冰箱保存。抽取保存 90、150、180、210、240、270d的各種滅活疫苗各1瓶進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.2 動物分組和免疫攻毒試驗(yàn) 將140只1日齡健康鴨隨機(jī)分成20組,每組7只。1～18組鴨在7日齡按表1經(jīng)胸部皮下注射不同疫苗作首免(0.4mL/只),14日齡作 2免(0.6mL/只)。19組為非免疫攻毒對照組,20組為健康對照組,不作免疫接種。21日齡對1～19組鴨用同源菌株菌液(菌液活菌數(shù)約為1.8×108CFU/mL)通過足墊部注射進(jìn)行攻毒;注射劑量0.5mL/只。第20組不攻毒作健康對照。攻毒后連續(xù)觀察10d,統(tǒng)計(jì)存活率,并對死亡鴨和存活鴨剖檢其病變,對可疑者作細(xì)菌分離鑒定。

表1 試驗(yàn)分組與處理

2 結(jié)果與分析

2.1 滅活疫苗安全性檢驗(yàn)結(jié)果 接種3種滅活疫苗后,雛鴨1d內(nèi)出現(xiàn)精神委頓,食欲下降,1d后精神、食欲恢復(fù)正常,試驗(yàn)結(jié)束未發(fā)現(xiàn)死亡病例,剖檢雛鴨無肉眼可見的病變,表明 3種滅活疫苗均具有良好的安全性。但油乳劑滅活疫苗組鴨,注射部位的肌肉可見一綠豆大小的硬塊。蜂膠和鋁膠滅活疫苗組鴨注射部位未見紅腫與異物。

2.2 RA滅活疫苗免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 從表2可見,油乳劑滅活疫苗隨保存時間的延長,免疫保護(hù)率保持穩(wěn)定有逐漸上升的趨勢,蜂膠滅活疫苗和鋁膠滅活疫苗隨保存時間的延長,免疫保護(hù)率有逐漸下降的趨勢。

同一保存時間不同佐劑疫苗比較,油乳劑滅活疫苗免疫保護(hù)率同比均優(yōu)于蜂膠滅活疫苗和鋁膠滅活疫苗。相同佐劑疫苗不同保存時間比較,油乳劑滅活疫苗免疫保護(hù)率比較穩(wěn)定,從90d到270d保存期疫苗免疫保護(hù)率維持在71.4%～100%之間,同比優(yōu)于蜂膠滅活疫苗和鋁膠滅活疫苗,保存270d的RA油乳劑滅活疫苗免疫保護(hù)率仍可維持在100%。不同保存期的蜂膠滅活疫苗,免疫保護(hù)率波動于42.9%～71.4%之間。鋁膠滅活疫苗的免疫效果基本與保存時間成反比關(guān)系,保存90d的疫苗免疫保護(hù)率為71.4%,保存240d的疫苗免疫保護(hù)率為33.3%,例外的是保存到270d的疫苗免疫保護(hù)率反而有所上升,為57.1%。

表2 3種不同佐劑不同保存時間免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

2.3 攻毒后剖檢結(jié)果 對攻毒死亡鴨剖檢可見,多數(shù)病死鴨發(fā)生纖維素性心包炎,心包積液,嚴(yán)重者心包膜與胸腔內(nèi)膜粘連;肝周炎,表面被裹淡黃色的纖維素性滲出物;其病變特征與鴨疫里默氏菌病典型病變相符。

3 討論

3.1 不同佐劑RA滅活疫苗免疫效果的比較 油佐劑是目前動物滅活疫苗中應(yīng)用最為廣泛、效果較為可靠的佐劑之一,可刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體。蜂膠內(nèi)含多種生物活性物質(zhì),配合抗原注入機(jī)體,可增強(qiáng)補(bǔ)體功能、增強(qiáng)免疫功能細(xì)胞及吞噬細(xì)胞數(shù)量,促進(jìn)抗體產(chǎn)生,從而增強(qiáng)免疫功能。但蜂膠佐劑的劑型較多,制法不一,并且不同工藝制備的蜂膠佐劑,對免疫作用的影響程度也不一樣[3]。鋁膠佐劑主要誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答,不能明顯地誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答。鋁膠佐劑在注射部位緩慢釋放抗原物質(zhì)的效應(yīng)較弱,因而佐劑活性較低,并且對許多抗原的免疫促進(jìn)作用都不明顯。由試驗(yàn)結(jié)果可見,RA油乳劑滅活疫苗的免疫保護(hù)率效果最好,其次是蜂膠滅活疫苗,最差的是鋁膠滅活疫苗。在270d的保存期內(nèi)6次免疫試驗(yàn),任何一次油乳劑滅活疫苗的免疫保護(hù)率都高于蜂膠滅活疫苗和鋁膠滅活疫苗,同比,蜂膠滅活疫苗稍優(yōu)于鋁膠滅活疫苗。這一結(jié)果與3種佐劑的基本特性相吻合。

3.2 相同佐劑不同保存時間RA滅活疫苗免疫效果的比較 RA油乳劑滅活疫苗從90d至270d不同保存時間的疫苗免疫保護(hù)率在71.4%～100%之間;疫苗保存270d高達(dá)100%,表明油乳劑滅活疫苗的有效保存時間最少可達(dá)270d;但90d、150d和240d疫苗免疫保護(hù)率出現(xiàn)波動,其原因可能由于不同保存期RA油乳劑滅活疫苗制備過程中存在誤差,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體水平存在差異。蜂膠滅活疫苗免疫保護(hù)率基本隨著保存時間的增長,表現(xiàn)下降趨勢(42.9%～71.4%)。鋁膠滅活疫苗免疫效果基本與保存時間成反比關(guān)系,下降趨勢比蜂膠滅活疫苗更明顯(33.3%～71.4%),提示 RA油乳劑滅活疫苗保存穩(wěn)定性較好,蜂膠滅活疫苗和鋁膠滅活疫苗保存穩(wěn)定性較差。

3.3 免疫注射局部反應(yīng) 經(jīng)試驗(yàn)觀察,注射油乳劑滅活疫苗組鴨,注射部位的肌肉可見一綠豆大小的硬塊,硬塊通常隨生長增長而消退,蜂膠和鋁膠滅活疫苗組鴨注射部位未見紅腫。由此可見3種RA滅活疫苗無明顯副反應(yīng)。

3.4 依據(jù)3種不同佐劑滅活疫苗免疫保護(hù)率的高低及其對雛鴨的副作用大小,建議廣大養(yǎng)殖戶選用油乳滅活疫苗對鴨疫里默氏菌病進(jìn)行免疫防治。

[1]姜平.獸醫(yī)生物制品學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2003：71-72.

[2]高福,郭玉璞.小鴨傳染性漿膜炎疫苗的研究[J].中國獸醫(yī)雜志,1987,13(6)：51-53.

[3]齊雪峰,楊曉燕,羅薇,等.幾種新型佐劑的研究近況及存在問題[J].中國家禽,2003,25(22)：44-45.