蔡其剛，馬利青

(青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧810016)

龔地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的重要機(jī)會致病性原蟲，可寄生于人和動物的除紅細(xì)胞外的有核細(xì)胞內(nèi)，引起弓形蟲病(Toxoplasmosis)[1]。貓及貓科動物是惟一可從糞便排出弓形蟲卵囊的動物，貓在弓形蟲傳播給綿羊和其他動物中起著重要作用。

P30蛋白又稱表面抗原1(SAG1)，為龔地弓形蟲速殖子期特異性蛋白，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG、IgM及多種細(xì)胞因子，具有重要的抗原性[2]。Dzierszinski F等根據(jù)基因敲除試驗認(rèn)為P30可能是決定蟲株毒力的重要因素之一[3]。為了摸清青海省綿羊中弓形蟲病的感染情況，我們運(yùn)用分子生物學(xué)方法克隆、表達(dá)、純化重組 GST-SAG1，然后以GST-SAG1作為 ELISA診斷抗原，建立了 ELISA診斷試劑盒，利用建立的 ELISA方法對采自青海省的綿羊進(jìn)行了弓形蟲病的血清學(xué)診斷，結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 抗原：GST-SAG1由日本國家原生動物疾病研究控制中心提供，青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)研究所生物技術(shù)研究室保存。

陰、陽性血清：均為日本國家原生動物疾病研究中心玄學(xué)南教授惠贈，青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)生物技術(shù)室保存。

被檢血清：2 402份被檢血清均采自青海省，以頸靜脈采集，采集后立即離心(3 000 r/min離心15 min)，血清析出后進(jìn)行收集，-20℃冷凍保存待檢。

其他試劑和耗材：均購自國內(nèi)和Sigma公司供應(yīng)商。

1.2 重組蛋白的表達(dá)、純化 將編碼 T.gondii SAG1的基因克隆至pGEX-4T-3質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到E.coli，獲得 GST-SAG1融合蛋白。GST-SAG1融合蛋白再用8 mol/L的尿素緩沖液透析復(fù)性，然后用于T.gondii的 ELISA診斷中。

1.3 抗原的包被 抗原GST-SAG1和GST，分別按5 μ g/mL劑量加到包被液中(50 mmol/L Carbonate-Bicarbonate Buffer，pH 9.6)，混勻后加到96孔平底微量板(Castor)的孔里，每孔 50 μ L，并且在4℃條件下培養(yǎng)過夜。

1.4 封阻 用含有0.05%Tween-20的 1×PBS沖洗1次后，用含3%脫脂乳的封阻液(3 g脫脂奶粉+90 mL蒸餾水+10 mL 10×PBS)進(jìn)行封阻，每孔 100 μ L，并在 37℃條件下培養(yǎng) 1 h。

1.5 加樣 微量板用PBS沖洗1次，在封阻液中按1∶100滴度稀釋陰、陽性標(biāo)準(zhǔn)血清、被檢血清后，每個樣品平行加到微量板的兩個孔中，每孔50 μ L，并在37℃條件下培養(yǎng)1 h。

1.6 加二抗 用PBS沖洗 6次后，在封阻液中按1∶4 000滴度稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊的IgG 抗體(Bethyl Laboratories，USA)，稀釋后每孔加 50 μ L，并在 37℃條件下培養(yǎng) 1 h。

1.7 底物 用PBS沖洗6次后，每孔加 100 μ L底物(每1 mL 底物中含有 0.3 μ g ABTS，0.1 mol/L檸檬酸緩沖液pH 4.0和 0.003%H2O2)，在室溫陰暗處放置1 h后讀數(shù)。

1.8 讀數(shù) 用 Wellscan MK 3酶標(biāo)儀(Labsystems Dragon，F(xiàn)inland)在 OD415 nm條件下測定光吸收值(OD)。

1.9 判定標(biāo)準(zhǔn) ELISA滴度表示成最大稀釋度的倒數(shù)，且展示ELISA值是等于或大于0.1，在抗原GST-SAG1孔和GST孔之間的光密度吸收值是不同的，兩孔陰性血清對照孔的平均值必須低于0.1，樣品ELISA抗體滴度值等于或大于0.1為陽性，低于0.1為陰性。

2 結(jié)果

對所收集的2 402份綿羊血清樣品應(yīng)用所建立的ELISA診斷試劑盒進(jìn)行血清學(xué)診斷，其中：土種綿羊血清 1 392份，檢出 25份陽性，陽性率為1.80%；改良綿羊血清786份，檢出27份陽性，陽性率為3.44%；小尾寒羊血清224份，檢出4份陽性，陽性率為1.79%。表明青海省的綿羊群中存在弓形蟲病的感染，見表1。

表1 弓形蟲ELISA診斷試劑盒的檢測結(jié)果

3 討論

3.1 本次共檢驗2 402份綿羊血清，檢出陽性數(shù)56份，陽性率為2.33%。其中：土種綿羊、改良綿羊和小尾寒羊的陽性率分別為 1.80%、3.44%和1.79%，本次調(diào)查結(jié)果表明，在青海省的綿羊群中存在弓形蟲的感染。弓形蟲的感染是否存在不同種群的易感性，有待于今后進(jìn)一步的研究。

3.2 加強(qiáng)弓形蟲病的檢疫淘汰，加強(qiáng)牧戶中貓的管理、搞好環(huán)境衛(wèi)生，力爭將弓形蟲病的危害降到最低程度。據(jù)報道，感染了弓形蟲的羊在人類弓形蟲病的傳播上有特殊作用[4]。因此，做好羊的弓形蟲病檢測及控制對防止人類弓形蟲病的發(fā)生有著重要的意義。

3.3 對弓形蟲病的治療藥物仍以磺胺類藥物和抗菌增效劑聯(lián)合使用療效最好。一些新的化療藥物對治療弓形蟲病具有良好的效果，但目前治療藥物的研究主要針對人弓形蟲病及小鼠弓形蟲病的模型建立，在弓形蟲病的治療方法上進(jìn)展不大，所以應(yīng)盡快評價這些藥物治療弓形蟲病的效果。

3.4 目前，國內(nèi)外專家學(xué)者已對弓形蟲病的流行、病原形態(tài)、生活史、診斷和免疫等方面做了大量研究工作，并取得了一定成績。但用于預(yù)防弓形蟲病發(fā)生的有效生物制劑尚需進(jìn)一步研究，對其發(fā)病機(jī)理和動物模型的研究，是為進(jìn)一步開發(fā)診斷試劑和建立有效控制方法的基礎(chǔ)。

[1] El Kouni M H.Adenosine metabolism in Toxoplasma gondii：potential targets for chemotherapy[J].CurrPharJ-Teisai Des，2007，13(6)：581-597.

[2] Seng S，Makala L H，Yokoyama M ，et al.SAG1 is a hosttargeted antigen for protection against Toxoplasma gondii infection[J].Pathobiology，2004，71(3)：144-151.

[3] Dzierszinski F，Mortuaire M，Cesbron-Delauw M F，et al.Targeted disruption of the glycosylpho sphatidy linositol-anchored surface antigen SAG3 gene in Toxoplasma gondii decreases host cell adhesion and drastically reduces virulence in mice[J].Mol Microbiol，2000，37(3)：574-582.

[4] 原永海，馬利青.小尾寒羊弓形蟲病血清抗體檢測[J].中國獸醫(yī)雜志，2007，43(8)：44.