魯杏華，朱中武，談志祥，何世成，范仲鑫，劉道新，邱立新

(1.湖南省動物疫病預防控制中心，湖南長沙410007；2.湖南出入境檢驗檢疫局，湖南長沙410003)

2008年5月，湖南省湘南地區(qū)某年出欄生豬2萬頭左右的規(guī)模化養(yǎng)豬場發(fā)生較為嚴重的母豬死亡及繁殖障礙、仔豬發(fā)病率和死亡率均較高的豬傳染病，經(jīng)發(fā)病情況調(diào)查、臨床癥狀、病理變化、實驗室診斷，確定為豬圓環(huán)病毒 2型、副豬嗜血桿菌混合感染。

1 流行情況

該場飼養(yǎng)繁殖母豬400多頭，存欄商品豬2 000多頭，為了品種改良于2008年3月上旬從異地引入3月齡種豬60頭，引入后28 d注射高致病性藍耳病滅活疫苗，7 d后開始發(fā)病，并快速傳染至原存欄仔豬和母豬。到4月底，共有發(fā)病仔豬376頭，死亡282頭；母豬發(fā)病34頭，死亡18頭。采用常用抗生素和中藥制劑進行治療，無明顯療效。

2 臨床癥狀

發(fā)病生豬精神倦怠，反應遲鈍，被毛粗亂，體溫升高至40℃～42℃，食欲減少或廢絕；體表皮膚出現(xiàn)紫斑，有些病例出現(xiàn)皮膚蒼白、局部發(fā)紺；結(jié)膜潮紅，呼吸困難，咳嗽，少數(shù)病例張口呼吸，呈犬坐姿勢，有些病例出現(xiàn)明顯的顫抖、關節(jié)腫脹、跛行、共濟失調(diào)、活動量減少等癥狀，隨后出現(xiàn)死亡；病豬體質(zhì)消瘦，仔豬病程約10～30 d。感染母豬流產(chǎn)或產(chǎn)弱仔等繁殖障礙癥狀，公豬出現(xiàn)跛行，繁殖性能降低，其中18頭母豬于高熱、食欲不振或廢絕4 d后因嚴重的呼吸障礙治療無效死亡，死亡前四肢劃動呈游泳姿勢[1-2]。

3 病理變化

眼觀可見：四肢、下腹、耳尖、會陰等末梢部位皮膚發(fā)紺，可視黏膜蒼白或黃染；剖檢眼觀病變可見腹膜、心包膜、胸膜等漿液性和纖維素性滲出，滲出物置空氣中呈膠凍狀，肺實質(zhì)性病變，病程較長的病例肺表面有大量纖維素性滲出，有些病例出現(xiàn)胸腔與胸壁粘連；肝腫大，表面有黃白色纖維素性滲出物；脾臟表面覆蓋有纖維素性滲出物；腎腫大，有多量白色斑塊；全身淋巴結(jié)腫大。腫大關節(jié)內(nèi)有多量關節(jié)積液。

組織學病變主要特點是纖維素化膿性炎癥，肺泡腔縮小，腔內(nèi)可見少量的紅細胞，肺泡間質(zhì)增寬，間質(zhì)中充滿有大量的紅細胞、嗜中性粒細胞、少量的淋巴細胞、單核細胞以及白細胞碎片；肝索紊亂，肝細胞顆粒變性或水泡變性，部分細胞出現(xiàn)核皺縮、破裂或溶解，肝竇變寬，可見較多嗜中性粒細胞、少量淋巴細胞和單核細胞浸潤[1-2，5]。

4 實驗室診斷

4.1 細菌學檢驗

4.1.1 細菌分離 用一次性注射器無菌采取豬肺、肝、脾、肺表面纖維素性滲出物、關節(jié)液，接種于巧克力平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)36～48 h后，巧克力平板內(nèi)均生長灰白色、光滑、透明的小菌落。該菌在普通鮮血瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂內(nèi)不生長，革蘭染色為陰性細小桿菌，具有多種不同的形態(tài)。再用巧克力瓊脂對細菌進行純化，取典型菌落進行生化鑒定[2-4]。

4.1.2 細菌生化鑒定 取經(jīng)巧克力平板純化的可疑菌落，進行煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生長依賴試驗、尿素酶試驗、CAMP試驗，結(jié)果表明該分離菌對NAD生物依賴，尿素酶試驗陰性，不溶血、CAMP試驗陰性，不發(fā)酵甘露醇、乳糖、木糖、L-阿拉伯糖，但能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和D-核糖。

4.1.3 分子生物學檢測 參考Oliveira S等[6]的方法進行副豬嗜血桿菌PCR檢測。將待檢可疑菌落接種于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～36 h，取1 mL培養(yǎng)液于經(jīng)滅菌處理的1.5 mL EP管，12 000 r/min離心5 min，沉淀懸浮于 100 μ L 滅菌水中，100℃水浴中煮5～10 min，然后迅速置于冰上冷卻5 min，10 000 r/min離心2 min，上清即為PCR模板。使用 1對引物(上游：5′-GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT-3′和 下游 ：5′-GGC T TC GTC ACC CTC TGT-3′)進行 PCR 擴增。反應體系 ：10 ×Taq Buffer 2.5 μ L ，2 μ mol/L dNTPs 2 μ L ，20 μ mol/L 上 、下游引物各 0.5 μ L ，Taq DNA聚合酶 0.5 μ L ，無菌水 15 μ L ，模板 4 μ L 。PCR 反應條件 ：95℃變性 5 min，94℃ 50 s、59℃ 1 min、72℃2 min，30個循環(huán)；72℃延伸 10 min。取 6 μ L PCR產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，可見預期大小的條帶，即副豬嗜血桿菌檢測為陽性，結(jié)果見圖1。

圖1 副豬嗜血桿菌分離株PCR產(chǎn)物電泳圖

4.1.4 藥敏試驗 用紙片法對分離菌株進行藥敏試驗，結(jié)果顯示該菌株對頭孢噻肟、氨芐西林、慶大霉素、新霉素較敏感；對磺胺二甲嘧啶、環(huán)丙沙星、阿米卡星、紅霉素、壯觀霉素、泰妙菌素不敏感。

4.2 病毒學檢驗

4.2.1 DNA/RNA抽提 隨機抽取病豬病理組織樣品4份，采用QiaGen公司提供的DNA/RNA提取試劑盒提取病毒DNA或RNA。

4.2.2 豬瘟病毒實時熒光 RT-PCR檢測 根據(jù)Promega公司提供的ONE-STEP qRT-PCR System配制反應體系，參照趙建軍等[7]的方法制備引物和探針，使用提取樣品的 RNA進行實時熒光RT-PCR檢測。反應條件為：45℃15 min；94℃5 min；94℃30 s，58℃ 45 s，72℃ 30 s，40 個循環(huán)擴增，退火延伸時收集熒光。陽性對照擴增到明顯的S曲線，Ct值為 29.6，被檢樣品均為陰性。

4.2.3 豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測 應用豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Nsp2 1594-1680變異株)RTPCR檢測試劑盒(購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司)對被檢樣品RNA進行PRRSV變異株檢測，檢測結(jié)果均為陰性(見圖2)。

圖2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

4.2.4 豬2型圓環(huán)病毒檢測 采用本實驗室建立的豬2型圓環(huán)病毒PCR檢測方法對5份被檢樣品檢測 PCV-2 ，使用 1 對引物(上游 ：5′-ACTCCGT TGTCCCTGAGAT-3′和 下 游 ：5′-TTACCGGCGCACT TCGGCAG-3′)對提取的 樣品 DNA 進行PCR擴增。反應條件：95℃ 3 min；95℃ 1 min，58 ℃30 s，72℃1 min，30 個循環(huán)；72℃延伸10 min。檢測結(jié)果為4份樣品PCV-2陽性，1份樣品PCV-2陰性，PCR凝膠電泳結(jié)果見圖3。

圖3 PCV-2 PCR產(chǎn)物電泳圖

5 藥物治療

采用該場使用較少的慶大霉素、氟甲硯霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星等抗生素進行治療(按說明書中治療劑量使用)，飼料中添加金霉素和泰樂菌素，飲水中添加口服補液鹽并同時注射維生素C，兩星期后該場疫情得到控制。

根據(jù)以上實驗室檢測結(jié)果，結(jié)合臨床癥狀和病理學變化及臨床治療效果，診斷該病例是由豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌混合感染而引起的豬傳染病。

6 綜合防制措施

6.1 隔離已感染病豬，及時淘汰失去經(jīng)濟價值的病豬，在進行病死豬尸體處理過程中嚴格遵守生物安全管理條例。

6.2 加強環(huán)境衛(wèi)生消毒，對空閑圈舍采用清水沖洗、有效藥物消毒、火焰消毒等消毒措施，消毒空閑3～7 d。舍內(nèi)走廊過道每周用有效藥物消毒1～2次。豬群視豬舍溫度不同，每月對豬消毒1～2次。生產(chǎn)用具每批豬或在每月消毒1次。各棟舍、生產(chǎn)單元、場門口等人員出入處設消毒池。常用的消毒藥物有火堿等?，F(xiàn)場監(jiān)測表明，火堿的消毒效果較好。但濃度需在4%以上。空閑豬舍可熏蒸消毒。對健康豬群加強管理，定期消毒，搞好通風換氣，飼料內(nèi)添加黃芪多糖和多種維生素，提高健康豬群的免疫力。密切關注豬群健康動態(tài)，對剛發(fā)病豬迅速隔離的同時注射干擾素，連用3 d。

6.3 加強引種管理，引種前對種豬場疫病情況進行系統(tǒng)全面了解，引種時逐頭采集引入種豬血樣對豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、胸膜肺炎放線桿菌等進行血清抗體檢測，檢測結(jié)果均為陰性者方可引入。種豬引入后隔離飼養(yǎng)45 d后方可混群。

6.4 保持衛(wèi)生和適當通風，及時清理糞便等污物，降低因污物發(fā)酵和腐敗產(chǎn)生的有害氣體對豬呼吸系統(tǒng)的損害。在進行走廊和圈舍清掃時應盡量避免塵埃向空氣中擴散。

[1] 斯特勞.豬病學[M].趙德明，張仲秋，沈建忠，等譯.8版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2000.

[2] 中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所.動物傳染病學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999.

[3] 中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所.獸醫(yī)微生物學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[4] R E布坎南，N E吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊[M].中國科學院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組，譯.8版.北京：科學出版社，1984.

[5] 王平利，梁宏德，陳福偉，等.豬副豬嗜血桿菌感染的病理學觀察[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2005(12)：82-84.

[6] Oliveira S，Galina L，PijoanC.Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections[J].J Vet Diag Invest，2001(13)：495-501.

[7] 趙建軍，成丹，李娜，等.豬瘟病毒實時熒光定量RT-PCR的建立及其對人工感染豬體內(nèi)豬瘟病毒的檢測[J].畜牧獸醫(yī)學報，2007，38(7)：685-693.