梁明珍,靳興軍,沈光年

(北京市獸醫(yī)實驗診斷所,北京朝陽100101)

鴨是禽流感傳播鏈中的一個重要環(huán)節(jié),能否有效防控鴨禽流感的關(guān)鍵之一是使用科學(xué)的檢測方法。目前,是參照禽流感血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗標(biāo)準(zhǔn)(GB/T18936-2003)[1],但是,鴨體內(nèi)含有非特異性抑制因子,血清中的唾液酸殘基會模擬紅細(xì)胞受體,同紅細(xì)胞受體競爭與流感病毒血凝素的結(jié)合,因而會導(dǎo)致非特異性抑制結(jié)果(假陽性)的出現(xiàn),用雞紅細(xì)胞懸液檢測水禽禽流感血清抗體時,常常存在非特異性凝集現(xiàn)象,出現(xiàn)前帶和后帶現(xiàn)象,有時能嚴(yán)重影響結(jié)果的判定。為此,本文采用不同種家禽的紅細(xì)胞懸液做重復(fù)試驗,探討水禽血清的處理方法及不同種的家禽紅細(xì)胞懸液對水禽禽流感血清抗體檢測的影響,在臨床應(yīng)用中,可為鴨禽流感免疫技術(shù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF公雞(梅里亞實驗動物中心)紅細(xì)胞懸液,非免疫鴨紅細(xì)胞懸液,禽流感H5亞型抗原和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所),RDE酶(中國疾病預(yù)防控制中心),96孔90度V型血凝反應(yīng)板,量程為5～50μL單道和八道的精確微量移液器。

1.2 樣品采集 采集北京市郊區(qū)縣蛋、肉用規(guī)?；N場、規(guī)?；唐穲?、農(nóng)村養(yǎng)殖戶鴨。

鴨待檢血清樣品通常選擇腿靜脈采血,每只采血樣2～3mL,經(jīng)2500r/min離心或自然放置析出血清。

1.3 試劑 配制 pH7.0～7.2、0.01mol/LPBS作為稀釋液;阿氏液(Alsevers)作為紅細(xì)胞保存液;1%和5%的雞 、鴨紅細(xì)胞懸液。

1.4 方法 采用禽流感血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(按GB/T18936-2003標(biāo)準(zhǔn))[1],《高致病性禽流感和口蹄疫等主要動物疫病免疫方案》(農(nóng)醫(yī)發(fā)[2008]5號),家禽免疫后21d進(jìn)行免疫效果監(jiān)測。存欄禽群免疫抗體合格率必須≥70%判定合格。禽流感抗體血凝抑制試驗(HI)抗體效價≥4log2為免疫合格,群體免疫抗體合格率必須≥70%判定合格。

2 鴨禽流感免疫抗體HI的判定標(biāo)準(zhǔn)和比較試驗

2.1 方法比較 方法1：鴨血清樣本經(jīng)5%雞紅細(xì)胞懸液處理。血清吸附處理方法：在V型血凝反應(yīng)板第1列孔中先加采集的鴨血清樣本50μL,然后再加5%雞紅細(xì)胞懸液50μL,振蕩混勻,室溫作用1h后作為待檢鴨血清樣本,按國標(biāo)進(jìn)行凝集抑制實驗。

方法 2：將待檢鴨血清樣本經(jīng)受體破壞酶(RDE)處理。RDE吸附處理方法：將待檢鴨血清與受體破壞酶按1∶4混合,經(jīng) 37℃水浴過夜,次日56℃滅活50min后,作為待檢鴨血清樣本,按國標(biāo)進(jìn)行凝集抑制試驗。

方法3：將未經(jīng)任何處理的待檢鴨血清樣本,按國標(biāo)進(jìn)行凝集抑制試驗,但分別用雞或鴨紅細(xì)胞懸液做對比改良試驗。

2.2 試驗結(jié)果 見表1、表2。

從表1和表2可以看出,經(jīng)5%雞紅細(xì)胞吸附處理的待檢鴨血清(加上處理時的稀釋度)比未經(jīng)5%雞紅細(xì)胞吸附處理后的待檢鴨血清HI效價平均值高0.55;未經(jīng)DEF處理的待檢鴨血清比經(jīng)DEF處理后的待檢鴨血清HI效價(加上處理時的稀釋度)平均值高0.10;加入1%鴨紅細(xì)胞懸液比加入1%雞紅細(xì)胞懸液的試驗HI效價平均值高0.8。經(jīng)DEF處理后的待檢鴨血清及加入1%鴨紅細(xì)胞懸液的HI試驗無非特異性凝集出現(xiàn)。所有試驗標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對照成立。

3 鴨禽流感免疫抗體HI方法的應(yīng)用

將重組禽流感滅活疫苗(H5N1亞型)進(jìn)行免疫,用HI方法,按表3進(jìn)行抗體監(jiān)測。

免后21d進(jìn)行監(jiān)測抗體,HI抗體平均水平小于或者等于4log2時,須加強(qiáng)免疫,以后每個月監(jiān)測抗體1次。通過對283個場戶,種鴨60只,肉鴨223只,1667份樣本監(jiān)測,免疫次數(shù)與免疫抗體效價如圖1,呈明顯正相關(guān)。

3.1 種鴨(蛋鴨) 分析10個區(qū)縣免疫合格率大于70%的場戶的免疫,發(fā)現(xiàn)首免時機(jī)集中在3～10日齡,2免時機(jī)集中在20～30d后,以后間隔免疫的時間平均為3個月,接種疫苗3次時有70%的場戶合格率達(dá)到70%,接種疫苗4次后有85%的場戶合格率達(dá)到70%,接種疫苗6次后,98%的場戶達(dá)到70%的合格率。

表1 3種方法凝集抑制試驗

表2 HI效價及非特異性凝集比較

表3 禽流感滅活疫苗免疫

圖1 免疫抗體監(jiān)測圖

3.2 肉鴨 分析10個區(qū)縣的15個場戶,發(fā)現(xiàn)首免日齡集中在3～7日齡,約50%的場戶在20日齡前后做了加強(qiáng)免疫。雖然抗體合格率不能達(dá)到70%,但通過野毒檢測,沒有感染情況出現(xiàn)。此外,根據(jù)實驗室的試驗,雛鴨的母源抗體一般可維持10～15d。

3.3 小鴨機(jī)體對免疫無可見的免疫應(yīng)答,其原因可能是受母源抗體的影響或與小鴨免疫系統(tǒng)尚未成熟有關(guān),由此啟示在鴨禽流感免疫中2周齡的小鴨尤其是生長期短的肉鴨,不能依賴主動免疫而應(yīng)加強(qiáng)種鴨免疫來提高母源抗體水平,使其建立良好的天然被動免疫。

3.4 從臨床觀察鴨經(jīng)禽流感疫苗免疫后無論抗體水平高低,帶毒檢測都為陰性,這種現(xiàn)象提示鴨經(jīng)禽流感疫苗免疫可降低甚至避免鴨群禽流感的帶毒現(xiàn)象。

4 討論

4.1 試驗結(jié)果表明,方法1可降低水禽血清中非特異性凝集因子對檢測的影響,但吸附不完全,方法繁雜,耗時長,不適合大批檢測;方法2可完全去除鴨血清中的非特異性凝集因子,但處理血清的成本高,對大批量檢測過程繁雜,在臨床中不易廣泛使用;方法3中用雞紅細(xì)胞懸液檢測鴨血清抗體有非特異性凝集現(xiàn)象,且出現(xiàn)前帶或后帶現(xiàn)象,干擾結(jié)果判定,抗體滴度均值比鴨紅細(xì)胞懸液檢測鴨血清抗體均值要低0.8個滴度。方法3中用鴨紅細(xì)胞來檢測鴨的禽流感血清抗體,幾乎可完全消除非特異性凝集因子對鴨禽流感抗體檢測的影響,與占松鶴[2]、吳俊華[3]、張評滸[4]等文章的研究結(jié)果一致,更能準(zhǔn)確客觀的反映抗體水平,適合在不增加檢測成本的基礎(chǔ)上大批檢測,筆者認(rèn)為該方法較好。

4.2 目前,控制鴨禽流感的主要手段是借鑒雞的免疫程序形成的免疫監(jiān)測體系。特禽、水禽等禽類接種流感疫苗免疫效力的評價還缺乏足夠的血清學(xué)依據(jù)。是否用同源紅細(xì)胞來檢測禽流感疫苗免疫效力評價方面有待于更多的工作和監(jiān)測數(shù)據(jù)予以支持。

4.3 北京市在2005年開始進(jìn)行對水禽的全面禽流感免疫,我們從免疫抗體主動監(jiān)測的上千份樣本數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn),鴨場按照其規(guī)程免疫過的鴨群中,免疫保護(hù)率如果按雞的保護(hù)率標(biāo)準(zhǔn)計算,同種類的疫苗在雞的保護(hù)率則高達(dá)90%以上,而鴨的抗體保護(hù)率則低于雞的保護(hù)率。

4.4 雞的禽流感免疫監(jiān)測體系不完全適合于鴨,經(jīng)過連續(xù)免疫抗體監(jiān)測試驗及帶毒篩查,證明H5N1亞型禽流感新型疫苗對水禽免疫有可靠效果,雖然鴨等水禽初次接種疫苗后保護(hù)率偏低,但多次免疫后免疫應(yīng)答良好,可避免感染和降低病毒的侵害,鴨禽流感抗體血凝方法檢測的應(yīng)用為鴨禽流感防控提供了有價值的數(shù)據(jù)依托。

[1]GB/T18936-2003,高致病性禽流感診斷技術(shù)[S].

[2]占松鶴,劉華.不同家禽紅細(xì)胞懸液檢測水禽禽流感抗體對比試驗[J].畜牧與飼料科學(xué),2009,30(5)：11-12.

[3]吳俊華,邱艷紅,葉瑋,等.用鴨紅細(xì)胞懸液消除非特異性凝集因子對鴨禽流感 HI試驗的影響[J].養(yǎng)禽與禽病防治,2006(12)：5-6.

[4]張評滸,唐應(yīng)華,仇旭升,等.不同家禽紅細(xì)胞懸液對禽流感血清抗體檢測的影響[J].中國獸醫(yī)科技,2005,35(4)：267-271.