梁明珍,靳興軍,沈光年

(北京市獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)診斷所,北京朝陽(yáng)100101)

鴨是禽流感傳播鏈中的一個(gè)重要環(huán)節(jié),能否有效防控鴨禽流感的關(guān)鍵之一是使用科學(xué)的檢測(cè)方法。目前,是參照禽流感血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T18936-2003)[1],但是,鴨體內(nèi)含有非特異性抑制因子,血清中的唾液酸殘基會(huì)模擬紅細(xì)胞受體,同紅細(xì)胞受體競(jìng)爭(zhēng)與流感病毒血凝素的結(jié)合,因而會(huì)導(dǎo)致非特異性抑制結(jié)果(假陽(yáng)性)的出現(xiàn),用雞紅細(xì)胞懸液檢測(cè)水禽禽流感血清抗體時(shí),常常存在非特異性凝集現(xiàn)象,出現(xiàn)前帶和后帶現(xiàn)象,有時(shí)能?chē)?yán)重影響結(jié)果的判定。為此,本文采用不同種家禽的紅細(xì)胞懸液做重復(fù)試驗(yàn),探討水禽血清的處理方法及不同種的家禽紅細(xì)胞懸液對(duì)水禽禽流感血清抗體檢測(cè)的影響,在臨床應(yīng)用中,可為鴨禽流感免疫技術(shù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF公雞(梅里亞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)紅細(xì)胞懸液,非免疫鴨紅細(xì)胞懸液,禽流感H5亞型抗原和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所),RDE酶(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心),96孔90度V型血凝反應(yīng)板,量程為5～50μL單道和八道的精確微量移液器。

1.2 樣品采集 采集北京市郊區(qū)縣蛋、肉用規(guī)?；N場(chǎng)、規(guī)?；唐穲?chǎng)、農(nóng)村養(yǎng)殖戶鴨。

鴨待檢血清樣品通常選擇腿靜脈采血,每只采血樣2～3mL,經(jīng)2500r/min離心或自然放置析出血清。

1.3 試劑 配制 pH7.0～7.2、0.01mol/LPBS作為稀釋液;阿氏液(Alsevers)作為紅細(xì)胞保存液;1%和5%的雞 、鴨紅細(xì)胞懸液。

1.4 方法 采用禽流感血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)(按GB/T18936-2003標(biāo)準(zhǔn))[1],《高致病性禽流感和口蹄疫等主要?jiǎng)游镆卟∶庖叻桨浮?農(nóng)醫(yī)發(fā)[2008]5號(hào)),家禽免疫后21d進(jìn)行免疫效果監(jiān)測(cè)。存欄禽群免疫抗體合格率必須≥70%判定合格。禽流感抗體血凝抑制試驗(yàn)(HI)抗體效價(jià)≥4log2為免疫合格,群體免疫抗體合格率必須≥70%判定合格。

2 鴨禽流感免疫抗體HI的判定標(biāo)準(zhǔn)和比較試驗(yàn)

2.1 方法比較 方法1：鴨血清樣本經(jīng)5%雞紅細(xì)胞懸液處理。血清吸附處理方法：在V型血凝反應(yīng)板第1列孔中先加采集的鴨血清樣本50μL,然后再加5%雞紅細(xì)胞懸液50μL,振蕩混勻,室溫作用1h后作為待檢鴨血清樣本,按國(guó)標(biāo)進(jìn)行凝集抑制實(shí)驗(yàn)。

方法 2：將待檢鴨血清樣本經(jīng)受體破壞酶(RDE)處理。RDE吸附處理方法：將待檢鴨血清與受體破壞酶按1∶4混合,經(jīng) 37℃水浴過(guò)夜,次日56℃滅活50min后,作為待檢鴨血清樣本,按國(guó)標(biāo)進(jìn)行凝集抑制試驗(yàn)。

方法3：將未經(jīng)任何處理的待檢鴨血清樣本,按國(guó)標(biāo)進(jìn)行凝集抑制試驗(yàn),但分別用雞或鴨紅細(xì)胞懸液做對(duì)比改良試驗(yàn)。

2.2 試驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表1、表2。

從表1和表2可以看出,經(jīng)5%雞紅細(xì)胞吸附處理的待檢鴨血清(加上處理時(shí)的稀釋度)比未經(jīng)5%雞紅細(xì)胞吸附處理后的待檢鴨血清HI效價(jià)平均值高0.55;未經(jīng)DEF處理的待檢鴨血清比經(jīng)DEF處理后的待檢鴨血清HI效價(jià)(加上處理時(shí)的稀釋度)平均值高0.10;加入1%鴨紅細(xì)胞懸液比加入1%雞紅細(xì)胞懸液的試驗(yàn)HI效價(jià)平均值高0.8。經(jīng)DEF處理后的待檢鴨血清及加入1%鴨紅細(xì)胞懸液的HI試驗(yàn)無(wú)非特異性凝集出現(xiàn)。所有試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對(duì)照成立。

3 鴨禽流感免疫抗體HI方法的應(yīng)用

將重組禽流感滅活疫苗(H5N1亞型)進(jìn)行免疫,用HI方法,按表3進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)。

免后21d進(jìn)行監(jiān)測(cè)抗體,HI抗體平均水平小于或者等于4log2時(shí),須加強(qiáng)免疫,以后每個(gè)月監(jiān)測(cè)抗體1次。通過(guò)對(duì)283個(gè)場(chǎng)戶,種鴨60只,肉鴨223只,1667份樣本監(jiān)測(cè),免疫次數(shù)與免疫抗體效價(jià)如圖1,呈明顯正相關(guān)。

3.1 種鴨(蛋鴨) 分析10個(gè)區(qū)縣免疫合格率大于70%的場(chǎng)戶的免疫,發(fā)現(xiàn)首免時(shí)機(jī)集中在3～10日齡,2免時(shí)機(jī)集中在20～30d后,以后間隔免疫的時(shí)間平均為3個(gè)月,接種疫苗3次時(shí)有70%的場(chǎng)戶合格率達(dá)到70%,接種疫苗4次后有85%的場(chǎng)戶合格率達(dá)到70%,接種疫苗6次后,98%的場(chǎng)戶達(dá)到70%的合格率。

表1 3種方法凝集抑制試驗(yàn)

表2 HI效價(jià)及非特異性凝集比較

表3 禽流感滅活疫苗免疫

圖1 免疫抗體監(jiān)測(cè)圖

3.2 肉鴨 分析10個(gè)區(qū)縣的15個(gè)場(chǎng)戶,發(fā)現(xiàn)首免日齡集中在3～7日齡,約50%的場(chǎng)戶在20日齡前后做了加強(qiáng)免疫。雖然抗體合格率不能達(dá)到70%,但通過(guò)野毒檢測(cè),沒(méi)有感染情況出現(xiàn)。此外,根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn),雛鴨的母源抗體一般可維持10～15d。

3.3 小鴨機(jī)體對(duì)免疫無(wú)可見(jiàn)的免疫應(yīng)答,其原因可能是受母源抗體的影響或與小鴨免疫系統(tǒng)尚未成熟有關(guān),由此啟示在鴨禽流感免疫中2周齡的小鴨尤其是生長(zhǎng)期短的肉鴨,不能依賴(lài)主動(dòng)免疫而應(yīng)加強(qiáng)種鴨免疫來(lái)提高母源抗體水平,使其建立良好的天然被動(dòng)免疫。

3.4 從臨床觀察鴨經(jīng)禽流感疫苗免疫后無(wú)論抗體水平高低,帶毒檢測(cè)都為陰性,這種現(xiàn)象提示鴨經(jīng)禽流感疫苗免疫可降低甚至避免鴨群禽流感的帶毒現(xiàn)象。

4 討論

4.1 試驗(yàn)結(jié)果表明,方法1可降低水禽血清中非特異性凝集因子對(duì)檢測(cè)的影響,但吸附不完全,方法繁雜,耗時(shí)長(zhǎng),不適合大批檢測(cè);方法2可完全去除鴨血清中的非特異性凝集因子,但處理血清的成本高,對(duì)大批量檢測(cè)過(guò)程繁雜,在臨床中不易廣泛使用;方法3中用雞紅細(xì)胞懸液檢測(cè)鴨血清抗體有非特異性凝集現(xiàn)象,且出現(xiàn)前帶或后帶現(xiàn)象,干擾結(jié)果判定,抗體滴度均值比鴨紅細(xì)胞懸液檢測(cè)鴨血清抗體均值要低0.8個(gè)滴度。方法3中用鴨紅細(xì)胞來(lái)檢測(cè)鴨的禽流感血清抗體,幾乎可完全消除非特異性凝集因子對(duì)鴨禽流感抗體檢測(cè)的影響,與占松鶴[2]、吳俊華[3]、張?jiān)u滸[4]等文章的研究結(jié)果一致,更能準(zhǔn)確客觀的反映抗體水平,適合在不增加檢測(cè)成本的基礎(chǔ)上大批檢測(cè),筆者認(rèn)為該方法較好。

4.2 目前,控制鴨禽流感的主要手段是借鑒雞的免疫程序形成的免疫監(jiān)測(cè)體系。特禽、水禽等禽類(lèi)接種流感疫苗免疫效力的評(píng)價(jià)還缺乏足夠的血清學(xué)依據(jù)。是否用同源紅細(xì)胞來(lái)檢測(cè)禽流感疫苗免疫效力評(píng)價(jià)方面有待于更多的工作和監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)予以支持。

4.3 北京市在2005年開(kāi)始進(jìn)行對(duì)水禽的全面禽流感免疫,我們從免疫抗體主動(dòng)監(jiān)測(cè)的上千份樣本數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn),鴨場(chǎng)按照其規(guī)程免疫過(guò)的鴨群中,免疫保護(hù)率如果按雞的保護(hù)率標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算,同種類(lèi)的疫苗在雞的保護(hù)率則高達(dá)90%以上,而鴨的抗體保護(hù)率則低于雞的保護(hù)率。

4.4 雞的禽流感免疫監(jiān)測(cè)體系不完全適合于鴨,經(jīng)過(guò)連續(xù)免疫抗體監(jiān)測(cè)試驗(yàn)及帶毒篩查,證明H5N1亞型禽流感新型疫苗對(duì)水禽免疫有可靠效果,雖然鴨等水禽初次接種疫苗后保護(hù)率偏低,但多次免疫后免疫應(yīng)答良好,可避免感染和降低病毒的侵害,鴨禽流感抗體血凝方法檢測(cè)的應(yīng)用為鴨禽流感防控提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)依托。

[1]GB/T18936-2003,高致病性禽流感診斷技術(shù)[S].

[2]占松鶴,劉華.不同家禽紅細(xì)胞懸液檢測(cè)水禽禽流感抗體對(duì)比試驗(yàn)[J].畜牧與飼料科學(xué),2009,30(5)：11-12.

[3]吳俊華,邱艷紅,葉瑋,等.用鴨紅細(xì)胞懸液消除非特異性凝集因子對(duì)鴨禽流感 HI試驗(yàn)的影響[J].養(yǎng)禽與禽病防治,2006(12)：5-6.

[4]張?jiān)u滸,唐應(yīng)華,仇旭升,等.不同家禽紅細(xì)胞懸液對(duì)禽流感血清抗體檢測(cè)的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,2005,35(4)：267-271.