楊光 裘正軍 劉君 畢維民 明晗昕 黃陳

靶向STAT3基因的RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

楊光 裘正軍 劉君 畢維民 明晗昕 黃陳

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指生物體內(nèi)由雙鏈RNA介導(dǎo)同源序列mRNA的特異性降解，從而導(dǎo)致基因沉默的現(xiàn)象[1]。通過合適的載體將RNA干擾片段轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞，可以有效地抑制功能基因的表達(dá)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducers and activators of transcription3, STAT3)是一個重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子，目前已將其定義為癌基因[2]。本實(shí)驗構(gòu)建針對STAT3序列的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株SW1990，建立STAT3基因穩(wěn)定沉默的SW1990細(xì)胞系。

一、材料與方法

1．小干擾RNA(siRNA)的設(shè)計及合成：根據(jù)網(wǎng)站(https://rnaidesigner·invitrogen·com/sirna/)提供的軟件設(shè)計合成3個靶向STAT3基因(NM_139276)的特異性siRNA，起始位置分別為466位點(diǎn)、 1638位點(diǎn)和1061位點(diǎn)。siRNA-1序列：5′-TAATGTTCTCTATCAGCACAATTTCAAGAGAATTGT-GCTGATAGAGAACATTTTTTTTC-3′，5′-TCGAGAAAAAAAATGTTCTCTATCAGCACAATTCTCTTGAAATTGTGCTGATAGAG-AACATTA-3′；siRNA-2序列：5′-TAACATCTGCCTAGATCGGCTATTCAAGAGATAGCCGATCTAGGCAGATGTTTTTTTTC-3′；5′-TCGAGAAAAAAaaCATCTGCCTAGATCGGCTATCTCTTGA-ATAGCCGATCTAGGCAGATGTTA-3′；siRNA-3序列：5′-TAA-CTTCAGACCCGTCAACAAATTCAAGAGATTTGTTGACGGGTC-TGAAGTTTTTTTTC-3′，5′-TCGAGAAAAAAAACTTCAGAC-CCGTCAACAAATCTCTTGAATTTGTTGACGGGTCTGAAGTTA-3′。引物由吉凱基因技術(shù)有限公司合成。

2．慢病毒包裝及病毒滴度測定：應(yīng)用Hpa I和Xho I酶切法將STAT3寡核苷酸片段插入pGCL-GFP質(zhì)粒構(gòu)建過表達(dá)STAT3的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑選氨芐青霉素抗性菌落并擴(kuò)增培養(yǎng)。提取質(zhì)粒DNA，PCR擴(kuò)增法鑒定陽性克隆并測序。將siRNA連接到病毒載體(吉凱公司)，使用lipofectamine 2000(invitrogen公司)將腺病毒和過表達(dá)STAT3的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，分別收集感染后48 h的293T細(xì)胞和培養(yǎng)上清液。裂解細(xì)胞沉淀，Western blotting檢查STAT3蛋白表達(dá)；培養(yǎng)上清離心、0.45 μm濾器過濾。將該病毒粗提液收集到濾杯中并加蓋，插入含濾過液的收集管，離心獲得病毒濃縮液，置-70℃保存。采用逐孔稀釋法測定病毒滴度。

3．慢病毒感染SW1990細(xì)胞及細(xì)胞STAT3mRNA、蛋白檢測：收集對數(shù)生長期SW1990細(xì)胞，接種于12孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞融合達(dá)30%～40%時，加入適量的STAT3-siRNA病毒感染3 d，觀察慢病毒的報告基因GFP，感染效率>50%者繼續(xù)培養(yǎng)。同時設(shè)為感染組及陰性對照表達(dá)(STAT3-Con)組收集感染的SW1990細(xì)胞。提取細(xì)胞總RNA，采用實(shí)時 PCR方法檢測STAT3 mRNA表達(dá)。STAT3上、下游引物序列為5′-CCAAGGAGGAGGCATTCG-3′，5′-ACATCGGCAGGTCAATGG-3′，產(chǎn)物147 bp；內(nèi)參β-actin上、下游引物序列為5′-TCGTGCGTGACATTAAGGAGSTAT-3′， 5′-AAGGTAGTTTCGTGGATGCC-3′，產(chǎn)物214 bp。以空病毒載體感染的SW1990為對照細(xì)胞。mRNA病毒量以2-ΔΔCt表示。ΔCt= Ct值目的基因-Ct值β-actin，-ΔΔCt= ΔCt對照組- ΔCt實(shí)驗組。實(shí)驗重復(fù)3次。同時收集細(xì)胞，制備勻漿，常規(guī)Western blotting檢測STAT3蛋白表達(dá)。以GADPH蛋白作為內(nèi)參照，用圖像分析軟件進(jìn)行光密度積分值分析。

4．感染細(xì)胞增殖檢測：無血清培養(yǎng)細(xì)胞18～20 h使細(xì)胞同步化。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h，分別用ATT法檢測細(xì)胞增殖。用A570值繪制生長曲線。

5．感染細(xì)胞周期測定：上流式細(xì)胞儀檢測。計算細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation index,PI)，PI=(S+G2)/(G1+S+G2)。

二、結(jié)果

1．負(fù)載siRNA的慢病毒載體的鑒定：靶向 STAT3的慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的效率約60%～70%，3個siRNA均有顯著敲減STAT3表達(dá)作用，以siRNA-2效果最為明顯(圖1)。病毒的滴度為1×109TU/ml。

2．慢病毒感染SW1990細(xì)胞后STAT3mRNA和蛋白表達(dá)的變化：慢病毒感染SW1990細(xì)胞24 h后，發(fā)現(xiàn)有熒光蛋白表達(dá)，且表達(dá)量隨時間遞增，到72 h達(dá)到最大，感染效率大于90%，此后保持在高表達(dá)狀態(tài)，沒有明顯下降。 感染含siRNA-2慢病毒的SW1990細(xì)胞STAT3 mRNA表達(dá)明顯被抑制，抑制率達(dá)80.6%(t=5.085,P=0.007);STAT3蛋白的表達(dá)亦明顯被抑制，抑制率達(dá)78.2%(t=14.278，P=0.000，圖2)。

1： 293T細(xì)胞組，2：STAT3過表達(dá)質(zhì)粒+病毒載體組，3：STAT3過表達(dá)質(zhì)粒+陰性對照病毒載體組，4：STAT3過表達(dá)質(zhì)粒+含siRNA-1病毒載體組，5：STAT3過表達(dá)質(zhì)粒+含siRNA-2病毒載體組，6：STAT3過表達(dá)質(zhì)粒+含siRNA-3病毒載體組

圖1感染負(fù)載不同siRNA慢病毒載體的293細(xì)胞的STAT3蛋白表達(dá)

圖2親本SW1990 和感染陰性對照慢病毒及含siRNA慢病毒的SW1990細(xì)胞的STAT3蛋白表達(dá)

3．細(xì)胞增殖的變化：培養(yǎng)48、72、96 h后，STAT3-siRNA組細(xì)胞增殖能力較STAT3-Con組或SW1990組明顯下降(P<0.05，圖3)。

圖3 各組SW1990細(xì)胞的增殖

4．細(xì)胞周期的變化：SSTAT3-siRNA組PI值明顯低于SW1990組或STAT3-Con組(t=4.894，P=0.008；t=6.592，P=0.003，表1，圖4)。

圖4 各組SW1990細(xì)胞周期

組別G1期G2期S期G2+S期(PI)SW199035.8±5.949.3±2.814.5±3.263.7±5.7STAT3-Con43.3±2.151.9±3.44.8±1.356.7±2.1STAT3-siRNA52.4±1.043.3±1.14.3±2.147.6±1.2ab

注：與SW1990組比較，aP<0.05；與STAT3-Con組比較，bP<0.05

討論JAKs/STATs途徑將細(xì)胞因子的信號從細(xì)胞表面?zhèn)鞯郊?xì)胞核的目的基因，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。STAT3在多種腫瘤組織中異常表達(dá)和激活，并與腫瘤的增殖、分化、細(xì)胞凋亡、血管生成、浸潤轉(zhuǎn)移和免疫逃避密切相關(guān)[3]。因此，有效抑制STAT3表達(dá)可能是治療高表達(dá)STAT3腫瘤的關(guān)鍵所在。

目前，RNAi作為一種研究手段被用于特異性抑制相關(guān)基因的表達(dá)，可成為腫瘤基因治療的新途徑[4-5]。RNAi常用的病毒載體有腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控、基因治療等領(lǐng)域。利用慢病毒載體構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體，與化學(xué)合成的siRNA和瞬時表達(dá)載體構(gòu)建的shRNA相比，一方面可以代替瞬時表達(dá)載體使用，另一方面，慢病毒載體經(jīng)過包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞等，并且在感染后整合到宿主細(xì)胞的基因組，而達(dá)到長時間的穩(wěn)定表達(dá)[6]。慢病毒載體轉(zhuǎn)移基因片段具有容量較大、目的基因表達(dá)時間長、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，因此成為攜帶siRNA的理想載體[7-8]。

Gao等[9]將STAT3特異性siRNA轉(zhuǎn)染到人喉癌Hep2細(xì)胞，能下調(diào)細(xì)胞中STAT3蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞的生長，促進(jìn)

細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。Xiong等[10]通過STAT3特異性siRNA體外轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞，能抑制細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。本研究構(gòu)建了靶向STAT3的特異性siRNA序列，通過慢病毒載體感染SW1990細(xì)胞，能顯著抑制細(xì)胞STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，明顯減慢細(xì)胞增殖，提示本實(shí)驗成功構(gòu)建了STAT3siRNA重組慢病毒質(zhì)粒，為進(jìn)一步了解STAT3基因的生物學(xué)特性并從分子水平探討胰腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，提供了有效的工具，具有重要的實(shí)驗價值。

[1] Hannon GJ.RNA interference.Nature,2002,418:244-251.

[2] Inghirami G,Chiarle R,Simmons WJ,et al.New and old functions of STAT3:a pivotal target for individualized treatment of cancer.Cell Cycle,2005,4:1131-1133.

[3] Haura EB,Turkson J,Jove R.Mechanisms of disease: Insights into the emerging role of signal transducers and activators of transcription in cancer.Nat Clin Pract Oncol,2005,2:315-324.

[4] Kamath RS,Fraser AG,Dong Y,et al.Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.Nature,2003,421:231-237.

[5] Takei Y,Kadomatsu K,Yuzawa Y,et al.A small interfering RNA targeting vascular endothelial growth factor as cancer therapeutics.Cancer Res,2004,64:3365-3370.

[6] Liau SS,Ashley SW,Whang EE.Lentivirus-mediated RNA interference of HMGA1 promotes chemosensitivity to gemcitabine in pancreatic adenocarcinoma.J Gastrointest Surg,2006,10:1254-1262.

[7] Scherr M,Eder M.Gene transfer into hematopoietic stem cells using lentiviral vectors.Curr Gene Ther,2002,2:45-55.

[8] Nishitsuji H,Ikeda T,Miyoshi H,et al.Expression of small hairpin RNA by lentivirus-based vector confers efficient and stable gene-suppression of HIV-1 on human cells including primary non-dividing cells.Microbes Infect,2004,6:76-85.

[9] Gao LF,Xu DQ,Wen LJ,et al.Inhibition of STAT3 expression by siRNA suppresses growth and induces apoptosis in laryngeal cancer cells.Acta Pharmacol Sin,2005,26:377-383.

[10] Xiong H,Zhang ZG,Tian XQ,et al.Inhibition of JAK1, 2/STAT3 signaling induces apoptosis,cell cycle arrest,and reduces tumor cell invasion in colorectal cancer cells.Neoplasia,2008,10:287-297.

2009-08-04)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.022

上海市教育委員會科研資助項目(06BE067)

271000 山東，泰安市中心醫(yī)院普外科(楊光、劉君、畢維民、明晗昕)；上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院普外科(裘正軍、黃陳)

裘正軍，Email：qiuwryb@online.sh.cn