吳葆瑩 吳崇旭 張志翔 劉彤
柴胡皂苷d對人胰腺癌細胞IkB激酶β表達的影響
吳葆瑩 吳崇旭 張志翔 劉彤
越來越多的研究表明,IκB激酶(inhibit kappa B kinase, IKK)的表達異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用[1-3]。中藥柴胡具有明顯的抗腫瘤作用,但是其具體作用機制不清。因此,本研究觀察柴胡主要藥理成分——柴胡皂苷d(Saikosaponin d, SSd)對人胰腺癌細胞IKK-β表達和凋亡的影響,為胰腺癌的治療提供新思路。
1.材料:人胰腺癌細胞株P(guān)ANC1購自意大利IST-Banca公司,DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均為美國Gibco公司產(chǎn)品;Trizol購自美國invitrogen公司,cDNA第一鏈合成試劑盒和PCR試劑盒均購自天根生物技術(shù)有限公司;IKK-β兔抗大鼠單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。
2.細胞培養(yǎng)與分組:PANC1細胞置無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),800 r/min離心5 min,棄上清;加入含150 ml/L胎牛血清、35.76 g/L HEPES和青、鏈霉素各100 U/ml的DMEM完全培養(yǎng)液,置5% CO2、37℃孵箱里貼壁生長至融合,隔日換液。待細胞生長至80%~90%融合時,用1.25 g/L胰蛋白酶消化傳代。以1×104/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板。將細胞隨機分為低、中、高劑量SSd組和對照組,分別加入終濃度為0.625 mg/L、1.25 mg/L、2.50 mg/L的SSd和PBS繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞。
3.細胞IKK-β mRNA水平檢測:Trizol提取各組細胞總RNA,取2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA。IKK-β上游引物5′-AGATCGCCTGTAGCAAA-3′,下游引物5′-CTCCAGTCT-AGGGTCGTG-3′,擴增片斷244 bp;內(nèi)參β-actin上游引物5′-GTTGACATCCGTAAAGACC-3′,下游引物5′-TCATCGTACTCC-TGCTTG-3′,擴增片斷233 bp。引物由金思特科技有限公司合成。PCR反應(yīng)條件:94℃ 5 min,94℃ 30 s、54℃ 40 s、72℃ 1 min,30個循環(huán),最后72℃ 5 min。產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,采用凝膠成像系統(tǒng)掃描,以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比作為mRNA相對表達量。
4.細胞IKK-β蛋白表達檢測:提取各組細胞總蛋白,常規(guī)行Western blotting檢測。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比作為IKK-β蛋白表達量。
5.細胞凋亡檢測:采用TUNEL法檢測。計數(shù)7個陽性細胞數(shù)最多的高倍視野的細胞,計算凋亡指數(shù)(apoptotic index, AI)。AI=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。
1.IKK-β mRNA和蛋白表達的變化:中、高劑量組細胞IKK-β mRNA水平、蛋白表達顯著低于低劑量組與對照組(P值均<0.05,圖1、表1),中、高劑量組之間以及低劑量組與對照組之間無統(tǒng)計學差異。
圖1 IKK-β PCR產(chǎn)物電泳圖(a: IKK-β;b:β-actin)
組別IKK-βmRNAIKK-β蛋白AI對照組7.860±1.5630.411±0.1920.58±0.16低劑量組6.345±1.9900.364±0.0753.80±0.91a中劑量組3.566±1.217ab0.236±0.068ab7.15±0.86ab高劑量組2.776±0.925ab0.172±0.064ab8.82±1.35ab
注:與對照組比較,aP<0.05;與低劑量組比較,bP<0.05
2.各組細胞凋亡:不同劑量SSd組的AI均顯著增加,且中、高劑量組AI較低劑量組也顯著增加(P值均<0.05,表1)。
討論IKK激酶家族屬于Ser/Thr蛋白激酶超家族成員,主要由IKK-α、IKK-β和IKK-γ 3個亞單位組成,其中IKK-α和IKK-β為功能單位,IKK-γ為調(diào)節(jié)單位,對IKK-α和IKK-β的活性進行調(diào)節(jié)。在靜息狀態(tài)下IKK處于無活性狀態(tài),當細胞受到病原微生物、應(yīng)激、細胞因子、氧自由基等刺激時,引起細胞內(nèi)一些上游激酶的活化,從而導(dǎo)致細胞內(nèi)IKK的絲氨酸殘基磷酸化而活化?;罨腎KK能使IκB發(fā)生降解,導(dǎo)致NF-κB活化,細胞抗凋亡能力增加,促進惡性腫瘤的發(fā)生。Li等[4]通過研究發(fā)現(xiàn),人胰腺癌細胞系的IKK-β和NF-κB處于持續(xù)激活狀態(tài)。而Ochiai等[5]利用RNA干擾技術(shù)刪除胰腺癌細胞IKK-β,此外還應(yīng)用特異性IKK-β抑制劑IMD-0354抑制其活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是基因刪除還是抑制其活性,均能明顯抑制癌細胞NF-κB活性和增殖,同時促進其凋亡反應(yīng),表明IKK-β可能是治療胰腺癌的一個重要分子靶點。
SSd是從傳統(tǒng)中藥柴胡中分離、提取出來的藥理活性最強的成分之一,具有解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎等藥理作用。近年研究表明,SSd通過直接細胞毒作用或影響腫瘤細胞黏附及誘導(dǎo)細胞凋亡等,抑制或殺死人肺癌、胃癌、肝癌、白血病細胞和小鼠移植性S-180實體瘤等腫瘤細胞[6-7],其抗腫瘤的作用引起學者高度關(guān)注。本研究以IKK-β為靶點,探討了SSd對其在胰腺癌PANC1細胞表達的影響。結(jié)果顯示,中、高劑量組的IKK-β mRNA水平及蛋白表達均顯著降低,同時三個干預(yù)組的AI值均顯著增高,表明SSd能夠在基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平抑制PANC1細胞IKK-β表達,促進細胞凋亡,而且這種作用呈一定劑量依賴性,可能是SSd治療胰腺癌的分子機制。
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2010-02-04)
(本文編輯:呂芳萍)
10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.024
300052 天津,天津醫(yī)科大學總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合外科(吳葆瑩),急診科(吳崇旭),普外科(張志翔、劉彤)
吳葆瑩,Email:0e25@sina.com