夏青 于觀貞 張其勝 王慧

·短篇論著·

人胰腺癌組織中Smad4、VEGF的表達(dá)及微血管密度檢測

夏青 于觀貞 張其勝 王慧

胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展伴隨著包括抑癌基因DPC4基因(編碼的蛋白為Smad4)在內(nèi)的許多基因改變，也伴隨著腫瘤血管的不斷生長。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化方法分別檢測胰腺癌組織中的Smad4、VEGF的表達(dá)，并計(jì)數(shù)微血管密度(MVD)，以了解三者的關(guān)系。

一、材料與方法

1．組織標(biāo)本：收集長征醫(yī)院2006年9月至2008年8月手術(shù)切除的胰腺癌組織標(biāo)本82例，男61例，女21例；年齡27～80歲，平均59歲；患者術(shù)前均未行放、化療。病理證實(shí)腺癌78例，腺鱗癌4例；癌腫位于胰頭58例，體尾部24例；按Edmondson組織學(xué)分級，高分化4例，中分化61例，低分化17例。另取經(jīng)手術(shù)以及病理證實(shí)的慢性胰腺炎(CP)組織標(biāo)本8例作為對照。

2．Smad4、VEGF、CD34蛋白檢測：采用免疫組化方法，試劑盒購自北京中山公司。石蠟包埋標(biāo)本連續(xù)切片4張，1張行HE染色，另3張行免疫組化染色。兔抗人Smad4多抗購自武漢博士德公司，鼠抗人CD34、VEGF單抗購自Santa Cruz公司。Smad4、CD34、VEGF一抗工作濃度分別為1∶100、1∶200、1∶200。PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，已知Smad4、CD34、VEGF陽性的切片作為陽性對照。

Smad4、VEGF染色陽性為胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色顆粒。每例隨機(jī)觀察5個視野，每個視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率，<5%為陰性，≥5%為陽性[1]。CD34陽性為內(nèi)皮細(xì)胞呈棕黃色或棕褐色，一個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞叢為一個微血管,只要結(jié)構(gòu)不相連,其分支結(jié)構(gòu)也作為一個微血管，而厚壁血管或管徑>50 μm 的血管則排除在外[2]。在血管密度最高處,高倍鏡下計(jì)數(shù)5個視野的微血管數(shù),其均值表示為MVD。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS11.5軟件，胰腺癌與CP組織的Smad4、VEGF以及MVD比較，采用兩樣本比較的秩和檢驗(yàn)；癌組織的Smad4、VEGF以及MVD相關(guān)性采用Sparman等級相關(guān)分析法，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1．Smad4、VEGF的蛋白表達(dá)及MVD：胰腺癌組織Smad4、VEGF的蛋白陽性表達(dá)率分別為34.1%、56.1%，MVD為19.00±8.91；CP組織分別為100.0%、12.5%和9.88±4.72。兩兩比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，圖1)。

2．胰腺癌組織Smad4、VEGF表達(dá)和MVD與臨床參數(shù)的關(guān)系：胰腺癌Smad4、VEGF表達(dá)及MVD與年齡、性別、腫瘤部位、病理類型無關(guān)；但高、中分化癌的Smad4陽性表達(dá)例數(shù)顯著高于低分化癌(P值均<0.05)，而高、中分化癌之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異， VEGF表達(dá)及MVD與腫瘤分化無關(guān)(表1)。

圖1胰腺癌組織中Smad4(a)、VEGF(b)和CD34(c)的表達(dá)(免疫組化 ×200)

表1胰腺癌Smad4、VEGF的表達(dá)以及MVD與臨床參數(shù)的關(guān)系

臨床指標(biāo)例數(shù)Smad4陽數(shù)例數(shù)VEGF陽性例數(shù)MVD(x±s)性別男61193418.8±8.7女2191219.7±9.6年齡<60歲36132017.8±8.1≥60歲46152619.9±9.5分化高43a114.5±11.2中6124a3619.0±8.9低171919.9±8.6病變部位頭部 58223019.1±8.3體尾部2461618.8±10.4病理類型腺癌 78264519.2±9.0腺鱗癌42114.5±6.7

注：與低分化比較，aP<0.05

3．胰腺癌組織Smad4、VEGF表達(dá)及MVD間的相關(guān)性: Smad4與VEGF間的Spearman系數(shù)為-0.244，P=0.027；Smad4與MVD間的Spearman系數(shù)為-0.35，P=0.001； VEGF與MVD間的Spearman系數(shù)為0.240，P=0.030。Smad4表達(dá)陽性者的VEGF表達(dá)率為39.3%，MVD為14.71±5.00，均顯著低于Smad4表達(dá)陰性組的64.8%和21.22±9.69(P=0.028和P=0.002)。

討論DPC4基因通常在染色體18q區(qū)發(fā)生改變。在胰腺癌中，DPVC基因的改變率約50%，其中純合子缺失約30%，突變約20%[3-4]。DPC基因的改變導(dǎo)致DPC蛋白的缺失。本組胰腺癌組織Smad4表達(dá)率為34.1%，顯著低于CP的100%的表達(dá)。

本組結(jié)果顯示，胰腺癌組織Smad4的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤部位、病理類型等無關(guān)，與鄭建明等[5]的報(bào)道基本相同；低分化癌的Smad4表達(dá)顯著低于中、高分化癌的結(jié)果與Zhan等[6]的報(bào)道相同。在胰腺癌組織中，Smad4與VEGF、MVD呈負(fù)相關(guān)， VEGF與MVD呈正相關(guān)，提示胰腺癌的生長離不開微血管的不斷生成以及促血管物質(zhì)VEGF對血管生成的促進(jìn)；而Smad4的存在可以抑制胰腺癌微血管生長以及VEGF的表達(dá)。與郝強(qiáng)等[7]及Khorana等[8]的結(jié)果相符。Khorana等[8]還對部分VEGF陽性以及Smad4陰性患者進(jìn)行了抗血管生成以及細(xì)胞毒作用的輔助治療，患者的生存期較未進(jìn)行輔助治療者明顯延長，也間接證實(shí)血管干預(yù)治療在延長胰腺癌患者生存期方面起著重要作用。

[1] Korchynskyi O，Landstrom M，Stoika R，et al.Expression of smad protein in human colorectal cancer.Int J Cancer,1999,82:197-202.

[2] Maeda K,Chung YS,Ogawa Y,et al.Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma.Cancer,1996,77:858-863.

[3] 潘小季，孫維佳.胰腺癌組織中DPC4/Smad4的表達(dá)及臨床意義.湘南學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,7:1-3.

[4] 李柯,陸星華.Smad4、Smad6、Smad7在胰腺癌中的改變及其相互關(guān)系.臨床消化病雜志,2005,4:151-154.

[5] 鄭建明，朱明華，倪燦榮,等.TGF-β/Smads信號通路相關(guān)蛋白在胰腺上皮內(nèi)瘤變和胰腺癌組織中的表達(dá).胰腺病學(xué),2004,4:204-209.

[6] Zhan H,Zhang YC,Hu XM, et al.Loss of DPC4 expression and its correlation with clinicopathological parameters in pancreatic carcinoma.World J Gastroen-terol,2003,9:2764-2767.

[7] 郝強(qiáng),田建明,左長京,等.胰腺癌組織的平均微血管密度和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá).第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,26:865-868.

[8] Khorana AA,Hu YC,Ryan CK,et al.Vascular endothelial growth factor and DPC4 predict adjuvant therapy outcomes in resected pancreatic cancer.J Gastrointest Surg,2005,9:903-911.

2009-10-27)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.023

200081 上海，上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院分院消化內(nèi)科(夏青、張其勝、王慧)；第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院腫瘤科(于觀貞)

夏青，Email:natureshandong@sina.com