程禮 胡國勇 何鴻霖 韓偉 王興鵬
·論著·
早期阻斷MCP-1對實(shí)驗(yàn)性急性壞死性胰腺炎的作用
程禮 胡國勇 何鴻霖 韓偉 王興鵬
目的探討趨化因子MCP-1對實(shí)驗(yàn)性急性壞死性胰腺炎(ANP)及其并發(fā)癥的影響。方法60只SD大鼠按數(shù)字表法分為假手術(shù)組、ANP組和MCP-1多抗干預(yù)組(干預(yù)組),各20只。采用3.5%牛黃膽酸鈉制備ANP模型,干預(yù)組于制模后0、6 h皮下注射抗MCP-1多抗。觀察血清淀粉酶、MCP-1、D-乳酸含量變化;觀察胰腺、肺、小腸組織病理改變及MCP-1 mRNA的表達(dá);檢測胰腺M(fèi)CP-1蛋白表達(dá);檢測肺、小腸髓過氧化酶(MPO)含量。結(jié)果干預(yù)組12 h的血淀粉酶、MCP-1、D-乳酸含量分別為(4666±412)U/L、(39.53±8.25)pg/ml 和(6.3±2.2)mg/L,均顯著低于ANP組的(9611±363)U/L、(63.42±9.32)pg/ml和(9.3±2.1)mg/L(P值均<0.05);胰腺、肺、小腸組織MCP-1 mRNA表達(dá)量分別為0.431±0.009、0.211±0.018和0.442±0.017,均顯著低于ANP組的0.624±0.010、0.523±0.019和0.569±0.024(P值均<0.05);胰腺M(fèi)CP-1蛋白表達(dá)評分為2.0±0.1,顯著低于ANP組的4.0±0.2(P<0.05);肺、小腸組織MPO含量分別為(11.1±3.0)U/g組織和(19.2±2.0)U/g組織,均與ANP組的(39.2±3.1)U/g組織和(13.1±2.1)U/g組織有顯著差異(P值均<0.05)。結(jié)論早期阻斷MCP-1不但可以減輕急性胰腺炎病理損傷,而且能減輕急性肺損傷和腸屏障的損傷程度。
胰腺炎,急性壞死性; 趨化因子類; MCP-1; 肺損傷; 腸道屏障
單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (monocyte chemotacite protein-1, MCP-1)屬于趨化因子CC亞家族,由67個氨基酸組成。它能促進(jìn)細(xì)胞遷移,誘導(dǎo)整合蛋白活化、細(xì)胞呼吸爆發(fā)和其他細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄,促使多種淋巴因子的釋放[1-2]。研究表明,胰腺腺泡細(xì)胞能持續(xù)合成MCP-1[3]。 Rau等[4]報(bào)道,急性胰腺炎(AP)有局部和(或)全身并發(fā)癥患者的血清和腹水中MCP-l含量明顯升高。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MCP-1多克隆抗體干預(yù)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠,觀察其對ANP及其并發(fā)癥的影響,為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
一、模型制備及分組
60只SD雄性大鼠,230~250 g,清潔級,上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院寶山動物實(shí)驗(yàn)室代購。按數(shù)字表法隨機(jī)分為ANP組、MCP-1干預(yù)組(干預(yù)組)和假手術(shù)組,各20只。以胰膽管內(nèi)逆行注射3.5%牛黃膽酸鈉(Sigma公司)1.5 ml/kg體重制備ANP大鼠模型。干預(yù)組于造模后0、6 h皮下注射30 mg/ml的兔抗鼠MCP-1多克隆抗體(上海交通大學(xué)藥學(xué)院韓偉實(shí)驗(yàn)室提供)100 μl。ANP組注射等體積的對照血清。假手術(shù)組輕觸胰腺后關(guān)腹。各組分別于術(shù)后6、12、24、48 h分批處死大鼠,取血并收集胰頭部組織、距回腸末端10 cm小腸組織和右中肺組織。
二、檢測指標(biāo)
1.血淀粉酶、D-乳酸及MCP-1檢測:淀粉酶由全自動生化儀測定。D-乳酸應(yīng)用D-乳酸試劑盒(Sigma公司)測定。MCP-1應(yīng)用ELISA法測定。
2.胰腺、小腸和肺組織病理學(xué)檢查:各組織置入10%甲醛固定,常規(guī)切片、HE染色,并閱片。
3.胰腺組織MCP-1蛋白檢測:采用ABC免疫組化方法。試劑盒購自武漢博士德生物科技公司,按說明書操作。以PBS代替一抗作為陰性對照,用已知表達(dá)MCP-1的組織作為陽性對照。結(jié)果采用半定量方法。以胞質(zhì)出現(xiàn)棕紅色顆粒為陽性,隨機(jī)選擇5個高倍視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分率,<5%計(jì)0分,5%~9%1分,10%~19% 2分,20%~50% 3分,>50% 4分,取均值。
4.小腸和肺組織MPO含量檢測:各組織分別勻漿后4℃離心,取上清液,采用MPO試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定MPO含量。
5.組織MCP-1 mRNA檢測:采用RT-PCR方法。應(yīng)用Trizol試劑提取組織總RNA。引物序列:MCP-1上游:5′-CACGCTTCTGGGCCTGTTG-3′,下游:5′-CAGCCGACTCATTGGGATCATC-3′,擴(kuò)增片段131 bp;內(nèi)參18 s RNA上游:5′-GGACCAGAGCGAAAGCATTTGC-3′,下游:5′-CGCCAGTCGGCATCGTITATG-3′,擴(kuò)增片段115 bp。PCR反應(yīng)條件: 95℃ 1 min,94°C 3 0 s、55℃(MCP-1)或58℃(18sRNA)30 s、72℃ 30 s, 30個循環(huán),72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離,圖像分析系統(tǒng)掃描,以MCP-1/18sRNA條帶的灰度值比作為MCP-1mRNA相對表達(dá)量。
三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
一、胰腺、小腸和肺組織病理改變
假手術(shù)組胰腺無顯著改變。ANP組6 h見胰腺間質(zhì)水腫,腺泡小葉結(jié)構(gòu)破壞,局灶凝固性或脂肪壞死,炎細(xì)胞浸潤增加;12 h胰腺組織片狀出血,大片壞死,血管破裂出血,大量中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤。干預(yù)組胰腺損傷較ANP組明顯減輕(圖1上)。
假手術(shù)組腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)完整。ANP組多數(shù)絨毛上皮壞死剝落,絨毛頂端間隙顯著,中央乳糜管擴(kuò)張,固有膜中度水腫伴炎癥細(xì)胞浸潤。干預(yù)組腸黏膜損傷較ANP組顯著減輕(圖1中)。
假手術(shù)組肺臟無異常變化。ANP組肺泡腫脹,間質(zhì)水腫、增厚、炎癥細(xì)胞聚集增多,局灶性肺不張。干預(yù)組僅見輕度肺泡腫脹,中性粒細(xì)胞浸潤減少(圖1下)。
圖1ANP組(a)和干預(yù)組(b)12 h的大鼠胰腺(上)、小腸(中)和肺(下)組織病理改變(HE ×100)
二、大鼠胰腺組織MCP-1蛋白表達(dá)的變化
ANP組6、12 h時可見腺泡細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)強(qiáng)陽性表達(dá),24 h時陽性細(xì)胞數(shù)減少。干預(yù)組見少量腺泡細(xì)胞陽性染色(圖2)。MCP-1蛋白表達(dá)評分見表1。
圖2ANP組(a)和干預(yù)組(b)12 h的胰腺M(fèi)CP-1表達(dá)(免疫組化 ×200)
表1 各組大鼠胰腺M(fèi)CP-1蛋白表達(dá)積分
注:與ANP組比較,aP<0.05
三、血淀粉酶、D-乳糖、MCP-1含量的變化
ANP組6 h時血清淀粉酶即升高,12 h達(dá)高峰。干預(yù)組血清淀粉酶僅12 h時較ANP組顯著下降(P<0.05,表2)。
ANP組血D-乳酸水平較對照組顯著升高(P<0.05),24 h到達(dá)峰值,干預(yù)組血D-乳酸水平較ANP組下降,48 h恢復(fù)正常(表2)。
ANP組6 h血清MCP-1含量顯著升高,12 h到達(dá)峰值。干預(yù)組各時間點(diǎn)MCP-1含量均較ANP組顯著降低(P<0.05,表2)。
表2 各組大鼠血清淀粉酶、D-乳酸、MCP-1活性變化
注:與ANP組比較,aP<0.05
四、小腸及肺組織MPO含量變化
ANP組及干預(yù)組小腸及肺組織MPO含量逐漸上升,12 h或24 h到達(dá)峰值,但干預(yù)組上升緩慢,均與ANP組有顯著差異(P<0.05,表3)。
五、胰腺、小腸及肺組織MCP-1 mRNA表達(dá)的變化
假手術(shù)組各組織MCP-1 mRNA表達(dá)無明顯變化。ANP組6 h時,胰腺、肺和小腸MCP-1 mRNA表達(dá)均顯著升高。干預(yù)組的胰腺、肺和小腸MCP-1 mRNA表達(dá)均較ANP組顯著下降(表4)。
表3 小腸及肺組織MPO含量的變化
注:與ANP組比較,aP<0.05
表4 胰腺、小腸、肺組織MCP-1 mRNA表達(dá)量的變化
注:與ANP組比較,aP<0.05
細(xì)胞因子尤其是趨化因子在AP的發(fā)病和疾病演變過程中的作用受到人們的日益關(guān)注,早期對細(xì)胞因子、趨化因子進(jìn)行干預(yù),防止胰腺炎向重癥發(fā)展,防治多器官功能衰竭已經(jīng)成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)[5]。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ANP大鼠MCP-1含量增高,胰腺組織MCP-1 mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)??筂CP-1抗體干預(yù)后,血清MCP-1含量顯著下降,胰腺病理損傷減輕,同時,肺組織損傷明顯減輕,肺MPO水平明顯下降。提示MCP-1在胰腺炎及其肺并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。此外,造模后6 h小腸MCP-1 mRNA表達(dá)升高,抗MCP-1抗體干預(yù)后,小腸組織MPO和血清D-乳酸含量明顯下降,腸黏膜病理損害減輕,提示阻斷MCP-1對腸屏障有保護(hù)作用。
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2009-11-23)
(本文編輯:屠振興)
EffectonblockadeofMCP1inearlycourseofexperimentalacutenecrotizingpancreatitis
CHENGLi,HUGuo-yong,HEHong-lin,HANWei,WANGXing-peng.
DepartmentofGastroenterology,ShanghaiFirstPeople′sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200080,China
WANGXing-peng,Email:xpwcn@public7.sta.net.cn
ObjectiveTo investigate the potential role of MCP-1/CCL2 in experimental acute necrotizing pancreatitis (ANP) and complications.Methods60 SD male rats were randomly divided into 3 groups: sham operation group(n=20),ANP group(n=20)and MCP-1 group(n=20). ANP model was induced by retrograde infusion of 3.5% sodium taurocholate, MCP-1 group
subcutaneous injection of MCP-1 antibody 0 h and 6 h after ANP induction. The serum levels of amylase, MCP-1, D-lactic acid, histological changes and the expression of MCP-1 mRNA of lung, small intestine and pancreas, the expression of MCP-1 protein in pancreas, MPO levels of small intestine MPO were determined.ResultsThe serum levels of amylase, MCP-1, D-lactic acid in MCP-1 group at 12 h were (4666±412)U/L, (39.53±8.25)pg/ml and (6.3±2.2)mg/L, which were significantly lower than those in ANP group [(9611±363)U/L, (63.42±9.32)pg/ml, (9.3±2.1)mg/L,P<0.05)]; the expression of MCP-1 mRNA in pancreas, small intestine and lung were 0.431±0.009, 0.211±0.018 and 0.442±0.017, which were significantly lower than those in ANP group [(0.624±0.010, 0.523±0.019 and 0.569±0.024,P<0.05)]; the expression of MCP-1 protein in pancreas was 2.0±0.1, which was significantly lower than that in ANP group (4.0±0.2,P<0.05). Lung and small intestine MPO were (11.1±3.0)U/g and (19.2±2.0)U/g, which were significantly lower than those in ANP group [(39.2±3.1)U/g and (13.1±2.1)U/g,P<0.05].ConclusionsEarly blockade of MCP-1 not only attenuates the severity of ANP, but also decreases the degree of acute lung injury and intestine barrier dysfunction.
Pancreatitis, acute necrotizing; Chemotactic factors; Monocyte chemotacite protein-1; Lung injuries; Enteral barrier
10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.015
200080 上海,上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科(程禮、胡國勇);上海交通大學(xué)農(nóng)學(xué)院(何鴻霖);上海交通大學(xué)藥學(xué)院(韓偉);同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院(王興鵬)
王興鵬,Email:xpwcn@public7.sta.net.cn