方華鎣 許春芳 葉建新

·論著·

褪黑素對小鼠皮下移植性胰腺癌的作用

方華鎣 許春芳 葉建新

目的探討褪黑素(MT)對Balb/c裸鼠胰腺癌皮下移植瘤的治療作用。方法建立Balb/c小鼠皮下胰腺癌移植瘤模型，分別用生理鹽水(對照組)、低劑量MT(10 mg·kg-1·d-1)、高劑量MT(20 mg·kg-1·d-1)、吉西他濱(GEM，50 mg·kg-1·d-1)及GEM +高劑量MT(聯(lián)合)干預(yù)，定期測量腫瘤大小，繪制腫瘤生長曲線，并用MTT法檢測小鼠脾臟自然殺傷細胞(NK)活性。結(jié)果對照組移植瘤體積為(1.476±0.075)cm3，低劑量MT組、高劑量MT組、GEM組和聯(lián)合組的移植瘤體積分別為(0.998±0.112)cm3、(0.756±0.128)cm3、(0.746±0.115)cm3和(0.305±0.111)cm3，較對照組顯著縮小(P值均<0.01)，并且高劑量MT組移植瘤體積較低劑量MT組小，聯(lián)合組移植瘤體積最小。對照組NK細胞的殺傷活性為(18.07±1.23)%，低劑量MT組、高劑量MT組和聯(lián)合組NK細胞的殺傷活性分別為(44.27±3.19)% 、(45.16±3.20)% 和(30.29±2.91)%，較對照組顯著增強(P值均<0.01)；GEM組NK細胞的殺傷活性為(14.24±2.70)%，較對照組顯著減弱(P<0.05)，而聯(lián)合組NK細胞的殺傷活性顯著高于GEM組(P<0.01)。結(jié)論MT能增強荷瘤裸鼠的免疫功能，抑制移植性胰腺癌的生長，與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用，則腫瘤抑制作用更強。

胰腺腫瘤； 褪黑激素； 疾病抵抗力； 吉西他濱

褪黑素(melatonin，MT)是松果體分泌的吲哚類激素，近期研究顯示其對乳腺癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤、結(jié)腸癌等都有顯著的抑瘤作用。我們前期的體外實驗研究[1]已證實，MT可以抑制胰腺癌SW1990細胞的增殖，促進其凋亡。本實驗通過建立小鼠移植瘤模型來研究MT對胰腺癌的治療效果，并探討褪黑素對荷瘤鼠免疫功能的影響。

材料與方法

一、小鼠胰腺癌模型建立及分組

雌性Balb/c小鼠，4～5周齡，平均體重18 g，由上海斯萊克實驗動物學(xué)有限責(zé)任公司提供；人胰腺癌SW1990細胞株由蘇州大學(xué)附屬一院血液研究所友情饋贈。取對數(shù)生長期的SW1990細胞，用無菌冷PBS洗滌后調(diào)整濃度至2×107/ml， 取100 μl接種于Balb/c小鼠右側(cè)前肢腋下，接種后第5天皮下腫瘤結(jié)節(jié)長徑約4～5 mm。將荷瘤鼠分成對照組、低劑量MT組、高劑量MT組、吉西他濱(GEM)組和高劑量MT+GEM組(聯(lián)合組)。對照組于腫瘤周圍皮下注射生理鹽水；低劑量MT組于腫瘤周圍皮下注射MT 10 mg·kg-1·d-1，1周連續(xù)注射4 d，連續(xù)3周；高劑量MT組于腫瘤周圍皮下注射MT 20 mg·kg-1·d-1，注射次數(shù)同上； GEM組向腹腔內(nèi)注射GEM 50 mg·kg-1·d-1，每周第1天和第4天注射，連續(xù)3周；聯(lián)合組于腫瘤周圍皮下注射 MT 20 mg·kg-1·d-1和腹腔注射GEM 50 mg·kg-1·d-1，用法同前。治療開始后定期用游標卡尺測量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，計算腫瘤體積(V)，V=a×b2/2。

二、NK細胞殺傷活性測定

1．效應(yīng)細胞的制備[2]：處死小鼠后迅速無菌摘除脾臟，制備單細胞懸液3 ml，將其輕輕地加到含有小鼠淋巴細胞分離液3 ml的試管中，離心收集白膜層,并用PBS洗滌,再置于細胞培養(yǎng)瓶中室溫孵育4 h,去除單核細胞，細胞懸液離心，收集沉淀的細胞，再懸浮，并調(diào)整細胞濃度為5×106/ml。

2．靶細胞的制備：K562白血病細胞株由蘇州大學(xué)附屬一院血液研究所友情饋贈。取對數(shù)生長期的K562細胞, 調(diào)整細胞濃度為5×104/ml。

3．細胞毒實驗：將效應(yīng)細胞、靶細胞各50 μl以100∶1的效靶比加入96孔板中,每樣本設(shè)三個復(fù)孔,同時設(shè)單純效應(yīng)細胞和單純靶細胞的對照孔,在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中共同孵育4 h,加入5 mg/L的噻唑鹽(MTT)10 μl后繼續(xù)孵育4 h,后加入10% SDS-50%二甲基甲酰胺100 μl,待紫色結(jié)晶完全溶解后,在酶標儀上測A570值。NK細胞殺傷活性=(A570反應(yīng)孔-A570自然釋放孔)/(A570最大釋放孔-A570自然釋放孔)×100 %。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、MT和GEM對胰腺癌皮下移植瘤的影響

接種后第21天，對照組小鼠的腫瘤體積平均為(1.476±0.075)cm3，低、高劑量MT組、GEM組及聯(lián)合組的皮下移植瘤體積平均為(0.998±0.112)cm3、(0.756±0.128) cm3、(0.746±0.115) cm3和(0.305±0.111)cm3，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=74.641,P<0.01)；低劑量MT組與高劑量MT組、GEM組組間的差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但GEM組與高劑量MT組間無明顯差異(P>0.05)；聯(lián)合組小鼠腫瘤體積最小，與其他各組間差異均顯著(P值均<0.01，圖1)。

圖1 荷瘤鼠腫瘤生長曲線

二、MT對NK細胞殺傷活性的影響

對照組、低劑量MT組、高劑量MT組、GEM組和聯(lián)合組的NK細胞活性分別為(18.07±1.23)%、(44.27±3.19)%、(45.16±3.20)%、(14.24±2.70)%和(30.29±2.91)%。高、低劑量MT組及聯(lián)合組的NK細胞殺傷活性較對照組均顯著增強(P值均<0.01),但高、低劑量MT組之間無明顯差異(P>0.05)；GEM組NK細胞殺傷活性較對照組顯著減弱(P<0.05)；聯(lián)合組小鼠NK細胞活性顯著高于GEM組(P<0.01),與低、高劑量MT組之間無顯著差異。

討 論

為研究MT對胰腺癌的治療作用,建立胰腺癌的實驗動物模型并在體內(nèi)實驗中加以證實是必不可少的。本研究采用的Balb/c裸小鼠是一種免疫缺陷性小鼠,目前被廣泛作為人類腫瘤的移植性腫瘤模型[3]。由于裸小鼠T細胞免疫缺陷,所以其NK細胞在抗腫瘤免疫中起著“主力軍”的作用,6～8周齡裸鼠的NK細胞在數(shù)量和功能上達到高峰，因此本實驗取4～5周齡裸鼠做實驗對象是一理想的選擇。

MT是人和哺乳動物松果體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，它除了調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的功能外，還具有抗腫瘤、抗氧化的作用[4]。其抗腫瘤機制是多方面的,不僅可以促進腫瘤細胞的凋亡[5]，改變細胞周期[1]，還能增強機體的免疫力。本實驗研究結(jié)果顯示，在移植性胰腺癌的周圍皮下注射MT可使腫瘤體積明顯縮小，證實MT可抑制胰腺癌的生長。

免疫系統(tǒng)是抑制腫瘤增殖的重要因素。近期研究發(fā)現(xiàn)，MT在神經(jīng)-免疫-腫瘤網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用。MT對免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用的主要靶細胞是NK細胞和吞噬細胞，可以使白血病老鼠的NK細胞數(shù)量和活性提高[6]，另外還可以刺激細胞因子的分泌[7]，而這些細胞因子的分泌又可促進NK細胞的活化[8]，為NK細胞的殺傷提供合適的體液環(huán)境，使之處于最佳的抗腫瘤狀態(tài)。本實驗結(jié)果顯示，MT可以顯著增強NK細胞的殺傷活性，從而提高機體的免疫力，發(fā)揮抗腫瘤作用。本結(jié)果還顯示，高劑量MT組的NK細胞殺傷活性和低劑量MT組間無明顯差異，但兩組的移植瘤大小存在明顯的差異，提示MT還可能通過其他的機制抑制腫瘤的生長。

在胰腺癌的治療中，GEM已取代5-FU成為目前胰腺癌一線的臨床化療藥。但在實際應(yīng)用中部分患者對GEM耐藥，而且GEM在抑制腫瘤生長的同時,也抑制了正常細胞的生理功能，導(dǎo)致廣泛的不良反應(yīng),如骨髓抑制引發(fā)的免疫功能低下等。眾所周知，免疫功能的低下可促進腫瘤的生長，這也是許多化療藥物療效較差的原因之一。Mills等[9]曾證實，MT無不良反應(yīng)，并且可降低其他藥物的不良反應(yīng)。本實驗也證實了同樣的結(jié)果，即MT和GEM聯(lián)合應(yīng)用對腫瘤的抑制作用強于單獨應(yīng)用GEM，這主要與MT可增強免疫系統(tǒng)的功能、降低GEM的不良反應(yīng)有一定的關(guān)系。

[1] 朱華,許春芳,葉建新.褪黑素對胰腺癌細胞株SW1990體外增殖及凋亡的影響.中華胰腺病雜志,2009,9:115-117.

[2] 王先松，盛秦，關(guān)陽.含GPG的寡脫氧核酸與5-氟尿嘧啶聯(lián)合治療小鼠肝癌.中華消化雜志，2005,25:212-215.

[3] Yokoi K,Sasaki T,Bucana CD,et al.Simultaneous inhibition of EGFR,VEGFR,and platelet derived growth factor receptor signaling combined with gemcitabine produces therapy of human pancreatic carcinoma and prolongs survival in an orthotopic nude mouse model.Cancer Res,2005,65:10371-10380.

[4] Ruiz-Rabelo JF，Vazquez R，Perea MD，et al.Beneficial properties of melatonin in an experimental model of pancreatic cancer.J Pineal Res,2007,43:270-275.

[5] Weinreb O,Mandel S,Youdim MB．cDNA gene expression profile homology of antioxidants and their antiapoptotic and proapoptotic activities in human neuroblastoma cells.FASEB J,2003,17:935-937.

[6] Miller SC,Pandi-Perumal SR,Esquifino AI,et al.The role of melatonin in immuno-enhancement: potential application in cancer.Int J Exp Pathol,2006,87:81-87.

[7] Srinivasan V,Spence DW,Pandi-Perumal SR,et al.Therapeutic actions of melatonin in cancer: possible mechanisms.Integr Cancer Ther,2008,7:189-203.

[8] Maestroni GJ.Therapeutic potential of melatonin in immunodeficiency states,viral diseases,and cancer.Adv Exp Med Biol,1999,467:217-226.

[9] Mills E,Wu P,Seely D,et al.Melatonin in the treatment of cancer: a systematic review of randomized controlled trials and meta-analysis.J Pineal Res,2005,39:360-366.

2009-09-21)

(本文編輯：屠振興)

Effectofmelatoninonthepancreaticcancerinmicesubcutaneousxenograft

FANGHua-ying,XUChun-fang,YEJian-xin.

DepartmentofGastroenterology,FirstPeople′sHospitalofSuzhou,SuzhouUniversity,Suzhou215006,China

XUChun-fang,Email：xcf601@163.com

ObjectiveTo investigate the therapeutic effects of melatonin (MT) on human pancreatic cancer in Balb/c nude mice subcutaneous xenograft model.MethodsPancreatic cancer model was established in Balb/c mice．The mice were treated with normal saline (control group), low dose MT(10 mg·kg-1·d-1), high dose MT(20 mg·kg-1·d-1) , gemcitabine(GEM,50 mg·kg-1·d-1) and high dose MT combination with GEM. Tumor size was measured regularly. The tumor growth curve was drawn.The activity of mice spleen natural killer cell was determined by MTT.ResultsCompared with the controls [(1.476±0.075)cm3], tumor volumes in low dose MT group[(0.998±0.112)cm3], high dose MT group[(0.756±0.128) cm3], GEM group [(0.746±0.115) cm3], combination group [(0.305±0.111) cm3] were significantly decreased (P<0.01), and the tumor size in high dose MT group was smaller than that in low dose MT group, while the tumor size in combination group was the smallest. The activity of mice spleen natural killer cell was (18.07±1.23)% in control group, and they were (44.27±3.19)%,(45.16±3.20)% and (30.29±2.91)% in low dose MT group, high dose MT group, combination group, which were significantly higher than those in the control group; the activity of natural killer cell in GEM group was (14.24±2.70)%, which was significantly lower than that in the control group (P<0.05), but the activity of natural killer cell in combination group was significantly higher than that in the GEM group (P<0.01).ConclusionsMT could improve the immune function of mice, inhibit the growth of tumor, and MT combination with GEM may have more potent antitumor effect.

Pancreatic neoplasms; Melatonin; Disease resistance; Gemcitabine

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.009

蘇州市社會發(fā)展基金(SSY0619)

215006 蘇州，蘇州大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科

許春芳，Email:xcf601@163.com