李先鵬 郭世偉 金震東 曲樂

·論著·

miR-101在胰腺癌組織中的表達以及對胰腺癌細胞ASPC-1增殖的影響

李先鵬 郭世偉 金震東 曲樂

目的觀察miR-101在胰腺癌組織中的表達，探討其對胰腺癌細胞增殖的影響。方法采用實時定量PCR方法檢測miR-101在胰腺癌組織、癌旁組織和胰腺癌細胞株ASPC-1中的表達。通過基因重組技術(shù)構(gòu)建miR-101的表達載體peGFPc1-miR-101，應(yīng)用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染到ASPC-1細胞，熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率；實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染細胞miR-101的表達水平，以癌旁正常胰腺組織為1，折算成相對倍數(shù)；MTT法檢測轉(zhuǎn)染細胞的增殖率。利用在線軟件targetScan預(yù)測miRNA可能的靶基因。結(jié)果miR-101在胰腺癌組織和胰腺癌細胞株ASPC-1中相對表達量分別為55%和39%，較癌旁正常胰腺組織顯著降低(P<0.01)。peGFPc1-miR-101轉(zhuǎn)染ASPC-1細胞后，miR-101表達增加，為對照組的19.8倍(P<0.01)，癌細胞增殖率明顯降低，最低僅為原代細胞的26%(P<0.01)。EZH2基因是miR-101影響胰腺癌細胞增殖活力的可能靶基因。結(jié)論胰腺癌組織miR-101低表達，它可能通過抑制EZH2的表達調(diào)控細胞的增殖。

胰腺腫瘤； miR-101； 細胞增殖

微小RNA(microRNA，miRNA)是近期發(fā)現(xiàn)的生物體內(nèi)源長度約為19～25個核苷酸的非編碼小RNA，通過與靶基因miRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)互補配對，而在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達進行調(diào)控，導致miRNA的降解或翻譯抑制。最近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，在各種腫瘤組織中存在miRNA的異常表達[1]。目前已有胰腺癌組織的miRNA異常表達譜的報道[2]，但針對某一特定異常表達的miRNA在胰腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的功能作用尚缺乏研究。為此，本實驗檢測miR-101在胰腺癌組織中的表達，探討其對胰腺癌細胞增殖的影響。

材料與方法

一、材料

真核表達質(zhì)粒載體peGFPc1購自Clonetech公司，E.coli DH5α感受態(tài)細胞購自天根生物公司。胰腺癌細胞株ASPC-1為本實驗室凍存。3例胰腺癌及其相應(yīng)癌旁正常胰腺組織為長海醫(yī)院手術(shù)切除的新鮮標本。Trizol、脂質(zhì)體、miRNAs檢測試劑盒等均購自Invitrogen公司，限制性內(nèi)切酶、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA marker、反轉(zhuǎn)錄酶、實時定量PCR試劑等均購自TAKARA公司，MTT試劑盒購自天根生物公司。

二、方法

1．miR-101表達的檢測：采用Trizol法提取胰腺癌組織、癌旁組織及胰腺癌細胞株ASPC-1細胞的總RNA。瓊脂糖凝膠電泳以及分光光度計分別檢測RNA濃度和質(zhì)量。

根據(jù)Gene Bank公布的人miR-1基因的序列，用primer primerer5.0軟件設(shè)計克隆引物。miR-101-F：GAAGATCTATATGGCCCATCTGAGGTTG，含Bgl Ⅱ酶切位點；miR-101-R：CCCAAGCTTAAAAACCTCCCACCACGAAT，含Hind Ⅲ酶切位點。內(nèi)參U6購自Invitrogen公司。引物由Invitrogen公司合成。以100 ng總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，RT反應(yīng)條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。再利用taqman miRNA assay進行實時PCR。PCR反應(yīng)：94℃ 10 min， 94℃ 30 s、60℃ 1 min，45個循環(huán)。每組實驗重復(fù)3次，結(jié)果用Ct值分析，以癌旁正常胰腺組織表達量為1，折算為相對倍數(shù)。每組PCR實驗均以持家基因U6作為內(nèi)參。

2．miR-101表達載體構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染：以人的基因組DNA為模板，PCR法擴增miR-101片段。 PCR反應(yīng)條件：94℃ 10 min，94℃ 30 s、55℃ 20 s、72℃ 15 s，30個循環(huán)，72℃延伸5 min。擴增片段經(jīng)電泳分離、回收，由Invitrogen公司負責測序。測序正確后，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶酶切，連接至質(zhì)粒peGFPc1中，構(gòu)建miR-101表達載體peGFPc1-miR-101。

將ASPC-1細胞按1×104個/孔的密度接種于96孔板常規(guī)培養(yǎng)。待細胞生長密度達60%～70%后，采用脂質(zhì)體Lipofectamine-2000將peGFPc1-miR-101轉(zhuǎn)染細胞。以僅加入脂質(zhì)體的細胞作為陰性對照。

3．轉(zhuǎn)染細胞增殖率檢測：轉(zhuǎn)染后0、12、24、48、72 h收集細胞，采用MTT法檢測細胞增殖活力。細胞相對增殖率=(實驗孔A530-空白孔A530)/(陰性對照孔A530值-空白孔A530)。實驗重復(fù)3次，取均值。

4．miRNA靶基因的預(yù)測：采用miRNA靶基因預(yù)測軟件targetScan(http://www.targetscan.org/)篩選miR-101靶向作用的基因。

結(jié) 果

一、 miR-101在胰腺癌組織中的表達

miR-101在胰腺癌和胰腺癌細胞株ASPC-1的相對表達量分別是癌旁正常胰腺組織的55%和39%，較癌旁正常胰腺組織顯著降低(P<0.01)。

二、peGFPc1-miR-101的鑒定

帶GFP報告基因的peGFPc1-miR-101轉(zhuǎn)染細胞24 h后，>70%的ASPC-1細胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光基因信號(圖1a)。轉(zhuǎn)染細胞的miR-101表達量明顯升高，為陰性對照組的19.8倍(P<0.01)，陰性對照組和空白對照組之間無明顯變化 (圖1b)。

圖1peGFPc1-miR-101轉(zhuǎn)染的ASPCA-1細胞(a)及其miR-101表達(b)

三、轉(zhuǎn)染細胞增殖的變化

轉(zhuǎn)染后12 h，細胞的增殖率降低，為對照組的85%；轉(zhuǎn)染后24 h，增殖率僅為對照組的27%(P<0.01)；轉(zhuǎn)染后72 h，增殖率為對照組的26%(P<0.01，圖2)。

圖2 轉(zhuǎn)染后ASPC-1細胞的生長曲線

四、miR-101抑制靶基因的篩選

根據(jù)targetScan的預(yù)測，miR-101在Zeste基因增強子(EZH2)的3′-UTR區(qū)域中有兩個作用位點，能較強地抑制該基因的表達(圖3)。

圖3 miR-101在Zeste基因增強子(EZH2)的靶位點

討 論

隨著研究的不斷深入，目前認為miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有與癌基因或抗癌基因相似的作用[3]。因此，深入研究miRNA在腫瘤中的功能，了解其作用的機制和通路，對腫瘤的治療、診斷以及進程監(jiān)控都具有重要意義[4]。

miR-101是脊椎動物所特有的一個miRNA，它有兩個前體，分別位于人的1號染色體和9號染色體中，但其成熟序列在各個物種中高度保守。目前已有研究證實，miR-101在肝癌、前列腺癌等實體腫瘤中發(fā)揮著重要的作用[5-7]。本結(jié)果顯示，miR-101在胰腺癌組織中表達降低，而轉(zhuǎn)染表達miR-101的胰腺癌細胞的增殖被明顯抑制，提示miR-101在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著如同抑癌基因的重要作用。Zeste基因增強子(EZH2)基因是哺乳動物細胞中的一個組蛋白甲基化酶，具有促進目標基因沉默的能力，對癌細胞的存活和轉(zhuǎn)移也具有重要的調(diào)控功能。

EZH2過度表達會導致癌細胞具有侵入性，加快實體腫瘤組織癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[8]。本實驗預(yù)測miR-101靶點在EZH2基因的3′-UTR區(qū)域，能抑制該基因的的轉(zhuǎn)錄后水平，從而達到抑制癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，與本實驗結(jié)果相符。

最近也有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞的抗凋亡基因MCL-1也是miR-101的靶基因之一[4,9-10]。MCL-1是一種受高度調(diào)節(jié)的蛋白，其表達受到各種生存及分化信號的調(diào)節(jié)。細胞凋亡的過程中它的表達下調(diào)，在細胞的存活過程中起著至關(guān)重要的作用。因此推測，在胰腺癌細胞的增殖過程中，MCL-1基因的表達可能也受miR-101的調(diào)控。

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2010-05-26)

(本文編輯：屠振興)

TheexpressionofmiR-101inpancreaticcanceranditseffectonproliferationofpancreaticcancercelllineASPC1

LIXian-peng,GUOShi-wei,JINZhen-dong,QULe.

DepartmentofGatroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

ObjectiveTo investigate the expression of miR-101 in pancreatic cancer and the effect of down-regulation miR-101 on proliferation of pancreatic cancer cell line ASPC1.MethodsReal-time PCR was used to determine the expression of miR-101 in pancreatic cancer, adjacent tissues and pancreatic cancer cell line ASPC-1. The miR-101 over-expression vector (peGFPc1-miR-101) was constructed and was transfected into ASPC-1 cell. Transfection efficiency was measured by fluorescence microscope. The expression of miR-101in the transfected cells was detected by real-time PCR. Cell viability analysis was performed by MTT. The targeted genes of miR-101 in pancreatic cancer were scanned by the online targeted gene prediction software (target Scan).ResultsThe expression of miR-101 was in pancreatic cancer tissues, adjacent tissues and ASPC-1 cell line, respectively. The expressions in pancreatic cancer tissues and ASPC-1 cells were significantly lower than that in adjacent tissues (P<0.01). The expression of miR 101 in transfected cells increased to 19.8 folds as much as that in the control group (P<0.01). Proliferation rate of transfected cells was significantly decreased, which was only 26% of primary cells (P<0.01). EZH2 was the potential targeted gene of miR-101 in pancreatic cancer.ConclusionsmiR-101 was weakly expressed and it may affect the proliferation of pancreatic cancer cell by inhibiting the EZH2 expression.

Pancreatic neoplasms; miR-101; Cell proliferation

Correspongdingauthor：JINZhen-dong,Email:zhendjin@126.com

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.016

200433 上海，第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院消化內(nèi)科(李先鵬、金震東)，普外三科(郭世偉)；第二軍醫(yī)大學(曲樂)

共同第一作者：郭世偉

金震東，Email:zhendjin@126.com