李敏王平 張林

1商丘師范學(xué)院體育學(xué)院（商丘 476000）

2太原科技大學(xué)體育系 3蘇州大學(xué)體育學(xué)院

肌腱在運動系統(tǒng)中具有重要作用，是肌肉收縮的第二機制。目前運動與肌腱的研究很活躍，但肌腱運動后適應(yīng)機制還不清楚。肌腱細胞外基質(zhì)的主要成分為膠原，它對維持肌腱的強度、傳遞肌肉所產(chǎn)生的力有重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，肌腱內(nèi)膠原合成速率要高于肌肉中膠原和肌蛋白的合成速率[1]，機械負載可以在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后水平上調(diào)控膠原的合成[2]。本實驗從分子水平觀察長期跑臺運動大鼠跟腱膠原和胰島素生長因子I（IGF-I）表達的變化，探討長期跑臺運動后跟腱適應(yīng)性機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

3月齡健康雄性 SD大鼠 20只（218.83±15.42g），購自蘇州大學(xué)動物中心，隨機分為對照組和運動組，每組10只。

1.2 運動方案

對照組不運動。運動組進行12周跑臺運動，第1周周一速度為12m/min，逐漸遞增，到周五時為20m/min，每天運動20min；第2周時速度不變，坡度為5%，運動時間增至30min；第3周到第12周速度為20m/min，坡度為10%，時間為40min。

1.3 檢測指標與方法

大鼠最后一次運動后24小時取材。對照組在運動組取材后第二天同一時間段取材。取材前以10%水合氯醛溶液腹腔注射（3ml/kg）麻醉大鼠。解剖后，經(jīng)腹主動脈取血約3ml，放入離心管中靜置30分鐘，隨后3000轉(zhuǎn)離心15分鐘，取上清液裝于凍存管中，密封，置于-80℃冰箱保存待測IGF-I。大鼠取血后迅速剝離后肢跟腱，去除腱圍及相連肌肉，置于凍存管中，在液氮中速凍1小時，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。一側(cè)跟腱用以mRNA表達的測定，另一側(cè)跟腱稱重后真空冷凍干燥用以多肽和蛋白質(zhì)的測定。

羥脯氨酸含量的測定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。I型膠原的前膠原氨基末端肽（PINP）、III型膠原的前膠原氨基末端肽（PIIINP）及IGF-I含量測定采用上海西唐生物科技有限公司提供的試劑盒，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，按試劑盒說明操作。

前膠原 Iα1mRNA、IIIα1mRNA 和 IGF-I mRNA表達水平采用實時熒光定量聚合酶反應(yīng)（real-time quantitative PCR）技術(shù)測定。用 Trizol（Invitrogen）提取跟腱總RNA。檢測濃度及純度后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Superscipt III Reverse Transcriptase，Invitrogen）在 PCR 儀（Eppendorf）中進行反轉(zhuǎn)錄（42℃，60min）。

基因引物序列根據(jù)Primer5.0設(shè)計，由上海英駿生物公司合成。以GAPDH為內(nèi)參照物，上游引物:5’-AGGTGACCGCATCTTCTTGTG-3’，下游引物:5'-CGTGGGTAGAGTCATACTGGAAC-3’，產(chǎn)物 大 小 為 202bp；ColIα1下游引物:5’-TCACCTACAGCACGCTTGTGG-3’，下游引物:5’-TTGGCTTTTGGGGAAATTGA-3’，產(chǎn)物大小為277bp；ColIIIα1上游引物:5’-GAACTCAAGAGCGGAGAATACTGG-3’，下游引物:5’-TGGTATGTAATGTTCTGGGAGGC-3’，產(chǎn)物大小為 302bp；IGF-I上游引物:5’-CTGGTGGACGCTCTTCAGTTC-3’，下游引物:5’-TTGGCAGGTGTTCCGATGTT-3’，產(chǎn)物大小為 380bp。使用Real-time PCR（SYBR Green I）Master Mix（TOYOBO），按試劑盒說明操作。95℃，3min預(yù)變性后，95℃ 20s，61℃20s，72℃ 30s，50 個循環(huán)。根據(jù) 2-ΔCt值計算 mRNA 表達的相對量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

運動組跟腱重量、羥脯氨酸含量與對照組相比雖有增加趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

如表2所示，運動組跟腱PINP含量和前膠原Iα1mRNA表達顯著高于對照組（P<0.01）；PIIINP含量和前膠原IIIα1mRNA表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。運動組血清IGF-I含量、跟腱IGF-I含量及IGF-I mRNA表達水平顯著高于對照組（P<0.01）。

表1 兩組大鼠跟腱重量和羥脯氨酸含量比較

表2 兩組大鼠跟腱膠原合成各指標和IGF-I表達比較

3 討論

3.1 長期跑臺運動對跟腱重量和羥脯氨酸含量的影響

羥脯氨酸是機體膠原蛋白的主要成分之一，在正常膠原蛋白中含量約為12.5%，在各型原膠原蛋白分子中含量穩(wěn)定，固定地出現(xiàn)在膠原蛋白分子G-L-Y結(jié)構(gòu)的Y區(qū)中，而在其它蛋白則少有存在，因此，羥脯氨酸的含量可作為衡量膠原組織代謝的重要指標。本研究中，大鼠經(jīng)過長期跑臺運動后跟腱重量和羥脯氨酸的含量與對照組相比雖有增加趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義，即總膠原含量未發(fā)生明顯變化，這表明12周長期運動中總膠原的合成與降解相對平衡。但未成熟小鼠進行跑臺訓(xùn)練后[3]、雞進行長期放養(yǎng)后[4]，其肌腱中膠原含量升高。故長期運動對肌腱膠原含量的影響可能與年齡及運動負荷有關(guān)。本研究中的大鼠經(jīng)過長期跑臺運動后，其肌腱膠原含量未發(fā)生改變，可能是由于實驗負荷（包括強度和時間）不足。

3.2 長期跑臺運動對膠原I和膠原III合成的影響

膠原合成過程中可溶性前膠原分泌到細胞外后，限制前膠原自我裝配的N-末端和C-末端被前膠原金屬蛋白酶切去，而后轉(zhuǎn)變成非溶性的原膠原，被切去的末端肽可特異性地反映某種類型膠原的合成[5]。本實驗結(jié)果顯示，大鼠經(jīng)過長期跑臺運動后跟腱PINP含量和前膠原Iα1mRNA水平與對照組相比顯著增加，表明長期跑臺運動不但使可溶性前膠原轉(zhuǎn)變?yōu)樵z原的過程加快，而且使跟腱中膠原I合成在轉(zhuǎn)錄水平上的表達上調(diào)。跟腱中PINP含量的變化可能受到最后一次運動的影響，如有研究表明一次運動后3天，甚至4天PICP的含量依然高于運動前[6]，但短時間加載肌腱前膠原Iα1mRNA水平并未發(fā)生變化[7]。這表明本研究中長期跑臺運動后其表達顯著增加是長期運動刺激的結(jié)果。此外，由于本研究中未測試跟腱膠原I含量的變化，膠原I合成的增加是否導(dǎo)致膠原I含量的增加還需要進一步證實，但膠原I合成的增多可能會改善膠原I的質(zhì)量，如增加膠原分子之間的交聯(lián)。因此，長期跑臺運動后跟腱可以通過增加膠原I合成量來適應(yīng)負荷。

長期跑臺運動后跟腱中前膠原IIIα1mRNA表達和PIIINP含量與安靜對照組相比未發(fā)生顯著變化，表明長期運動后肌腱膠原III合成不再增加。肌腱中膠原III含量很少，形成的纖維較細但彈性較高，其含量增加在一定程度會降低肌腱的強度。膠原III合成不再增加提示長期跑臺運動后跟腱已對所處的力學(xué)環(huán)境產(chǎn)生了一定適應(yīng)。

3.3 長期跑臺運動對IGF-I的影響

研究表明IGF-I直接參與了與機械負載相關(guān)的肌腱細胞外基質(zhì)合成[8，9]。但有關(guān)IGF-I在運動后肌腱適應(yīng)中的作用還不清楚。本研究中長期耐力跑臺運動組大鼠血清IGF-I含量與對照組相比顯著增加，表明長期運動可提高依賴于垂體GH途徑的IGF-I合成。IGF-I作為一種多肽生長因子，可通過自分泌和旁分泌的方式作用于自身和其它細胞，循環(huán)系統(tǒng)中IGF-I含量的增加可增強其對全身組織的生物學(xué)效應(yīng)。

本研究中，長期運動后大鼠跟腱內(nèi)IGF-I在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著高于對照組，表明長期運動可上調(diào)跟腱內(nèi)源性IGF-I合成。長期跑臺運動后跟腱內(nèi)IGF-I表達增加與前述膠原I表達增高一致，這表明長期跑臺運動后IGF-I在肌腱細胞外基質(zhì)的代謝適應(yīng)中具有一定的作用。運動對局部組織刺激增加，經(jīng)不依賴于垂體GH的途徑，即局部機械刺激的作用上調(diào)IGF-I的合成。長期跑臺運動后IGF-I表達與膠原I合成的一致性，表明IGF-I在長期跑臺運動后的跟腱適應(yīng)中具有一定作用。

研究表明，運動可使局部跟腱組織血流量增加[10，11]，從而增強長期運動的系統(tǒng)效應(yīng)對局部組織的影響，即長期耐力跑臺運動后，不但內(nèi)源性IGF-I合成增加影響了跟腱的代謝，循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)IGF-I也增加，從而增加組織損傷修復(fù)的潛能[12，13]。

4 小結(jié)

長期耐力跑臺運動后跟腱改變的是膠原質(zhì)量而非數(shù)量，跟腱通過提高跟腱膠原I的合成來適應(yīng)負荷。血清和跟腱IGF-I的提高表明其在跟腱對長期跑臺運動的適應(yīng)中具有一定作用。

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