杜艷艷 鄭陸 王超

首都體育學(xué)院（北京 100088）

大量研究證實(shí)，合理的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷有助于骨量增加[1，2]和骨力學(xué)性能改善[3，4]。但對(duì)于某些特殊人群，尤其是專(zhuān)業(yè)運(yùn)動(dòng)員，因長(zhǎng)期超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，可能出現(xiàn)體內(nèi)雌激素水平下降[5]，骨密度降低[6]及應(yīng)力性骨折等負(fù)面效應(yīng)[7，8]。我們前期建立的遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)骨量降低動(dòng)物模型[9]顯示，隨著遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)的進(jìn)行，SD大鼠骨密度發(fā)生顯著變化。骨的生物力學(xué)性能由骨質(zhì)量、骨密度、骨的幾何分布（結(jié)構(gòu)）以及微結(jié)構(gòu)的完整程度四者共同決定[10]，評(píng)價(jià)指標(biāo)可以分為結(jié)構(gòu)力學(xué)性能指標(biāo)和材料力學(xué)性能指標(biāo)，其中，最大載荷主要反映骨抵抗破壞的能力，是反映骨生物力學(xué)性能的主要指標(biāo)之一。為了探究遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨量降低SD大鼠股骨和腰椎抵抗骨折能力的變化，本研究分別對(duì)造模同期大鼠的左股骨和第二腰椎進(jìn)行三點(diǎn)彎試驗(yàn)和壓力試驗(yàn)[11]，并進(jìn)行運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組間的橫向和各組自身的縱向比較，為探討長(zhǎng)期遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)與骨最大載荷變化的關(guān)系和機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

170只（體重 275.27±20.674g）未交配的 3月齡健康SD雌性大鼠（采購(gòu)并飼養(yǎng)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物許可證SCXK（京）2006-0008，實(shí)驗(yàn)環(huán)境許可證 SYXK（京）2006-0025）]，采用分籠、自由進(jìn)食飲水的飼養(yǎng)方式，喂食國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物常規(guī)飼料，環(huán)境溫度18～24℃，相對(duì)濕度45～55%。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

進(jìn)行為期一周的適應(yīng)性訓(xùn)練后，將大鼠隨機(jī)分為基礎(chǔ)對(duì)照組（Co，n=10），遞增負(fù)荷訓(xùn)練組（T2W，T4W，T6W，T8W，T9W，T11W，T13W與T15W，各10只）和各訓(xùn)練周期的對(duì)照組（C2W，C4W，C6W，C8W，C9W，C11W，C13W與 C15W，各 10 只）。

1.3 訓(xùn)練方案

參照Bedford[12]的動(dòng)物耐力運(yùn)動(dòng)負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)以及鄭陸等[13]的前期相關(guān)研究制定遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)方案，具體如表1。利用杭州段式（PT2000型）跑臺(tái)，每周運(yùn)動(dòng)6天，休息1天，最長(zhǎng)訓(xùn)練時(shí)間為15周。

表1 本研究采用的運(yùn)動(dòng)方案Table 1 Training protocol in the study

1.4 骨標(biāo)本的取材與制備

1.4.1 骨取材

將大鼠麻醉，抽血致死，取左股骨和第二腰椎，剔除主要肌肉，滅菌，噴灑生理鹽水后以紗布包裹，裝入帶有標(biāo)記的凍存管，保存在液氮中待用。

1.4.2 骨標(biāo)本的制備

實(shí)驗(yàn)前將骨從液氮轉(zhuǎn)放于－20℃的冰箱中，實(shí)驗(yàn)前半天將標(biāo)本保存到4℃冰箱中解凍備用。

股骨標(biāo)本的制備:將股骨上的殘留肌肉及結(jié)締組織清除干凈。第二腰椎標(biāo)本的制備:首先剔除椎骨上殘留的肌肉，用剪刀剪去棘突，得到椎體部分，然后用手術(shù)刀切除椎盤(pán)，最后用粗、細(xì)砂紙將椎體的上下表面打磨平整且保證上下面平行。注意整個(gè)過(guò)程中適量噴生理鹽水于椎體上以保持其新鮮，并盡量減少整個(gè)處理過(guò)程的時(shí)間。

1.5 測(cè)試方法

生物復(fù)合材料試驗(yàn)系統(tǒng)（MTS 858，MTS Systems Corporation，USA；南方醫(yī)科大學(xué)臨床解剖學(xué)研究所）。左股骨的三點(diǎn)彎試驗(yàn)（three-point bending test），加載速度v=1mm/min，最大加載位移Smax=3.5mm，測(cè)試時(shí)試件的放置如圖1；第二腰椎椎體的壓力試驗(yàn)（compressive test），加載速度v=1mm/min，最大加載位移Smax=3.5mm，測(cè)試時(shí)試件的放置如圖2所示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，對(duì)整個(gè)研究過(guò)程中的對(duì)照組（C）和運(yùn)動(dòng)組（T）用 one-way ANOVA方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P=0.05）。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)大鼠在經(jīng)歷生長(zhǎng)、訓(xùn)練、取材和測(cè)試過(guò)程中，由于受傷、死亡等客觀原因，最終實(shí)際可用樣本量有所變化。

2.1 股骨最大載荷的變化

實(shí)驗(yàn)周期對(duì)照組與運(yùn)動(dòng)組股骨最大載荷的均值曲線圖如圖3。

2.1.1 對(duì)照組股骨最大載荷變化

表2顯示，C0組股骨最大載荷 F（N）與 C4W組及后期各組大鼠均存在顯著性差異（P<0.01）；C2W組與其它各組均存在顯著性差異（P<0.05）；C4W、C6W、C8W組與C9W及其之后各組間存在顯著性差異（P<0.05）；C9W組與所有組間均存在顯著性差異（P<0.05）；C11W組與除 C15W組外的其它各組間都存在顯著性差異（P<0.05）；C13W組與C9W及C15W組外的各組間存在顯著性差異。另外，圖3顯示C11W組最大載荷均值達(dá)整個(gè)研究過(guò)程的最大值。

表2 對(duì)照組間股骨最大載荷差異的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Analysis of the maximum force of femoral bone specimens in all control groups by one-way ANOVA

2.1.2 運(yùn)動(dòng)組股骨最大載荷變化

表3顯示，運(yùn)動(dòng)組股骨的最大載荷，T2W組與T6W及其之后的各運(yùn)動(dòng)組間均表現(xiàn)出顯著性差異（P分別為0.001，0.014，0.000，0.000，0.000，0.001）；T4W組與 T6W組及9周之后的各組間也都存在著顯著性差異（P分別為0.043，0.002，0.001，0.001，0.032）；T6W組與之 后的各組差異不顯著；除T8W組與T11W組之間表現(xiàn)出顯著性的差異之外，8周之后各組間未見(jiàn)顯著性差異。

表3 運(yùn)動(dòng)組間股骨最大載荷差異的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 兩組股骨最大載荷比較

實(shí)驗(yàn)周期中，對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組之間其股骨最大載荷均無(wú)顯著性差異。此外，除去基礎(chǔ)對(duì)照組，將整個(gè)研究中對(duì)照組與運(yùn)動(dòng)組看作兩個(gè)獨(dú)立樣本進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示兩組間仍無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

2.2 腰椎最大載荷的變化

實(shí)驗(yàn)周期對(duì)照組與運(yùn)動(dòng)組第二腰椎最大載荷均值曲線圖見(jiàn)圖4。

2.2.1 對(duì)照組第二腰椎最大載荷變化

表5顯示，從C8W組開(kāi)始，各組第二腰椎最大載荷均與基礎(chǔ)對(duì)照組有顯著性差異（P分別為0.030，0.000，0.001，0.001，0.000），C9W組與除 C13W及 C15W組之外的各組間均存在顯著性差異，9周之后各組間均未表現(xiàn)出顯著性差異。

2.2.2 運(yùn)動(dòng)組第二腰椎最大載荷變化

表6顯示，T9W組第二腰椎最大載荷與其之前的T2W、T4W、T6W組及之后的 T11W、T13W、T15W組均表現(xiàn)出顯著性差異（P<0.01），同時(shí)T15W組與T11W及T13W組間也表現(xiàn)出了顯著性差異（P分別為0.028，0.003）。

2.2.3 兩組第二腰椎最大載荷比較

表7顯示，實(shí)驗(yàn)周期中，對(duì)照組與運(yùn)動(dòng)組第二腰椎最大載荷比較中，C11W與 T11W，C13W與 T13W以及 C15W與 T15W之間分別有顯著性差異（P分別為 0.001，0.030，0.000）。除基礎(chǔ)對(duì)照組外，將本研究對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組看作兩個(gè)獨(dú)立樣本進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示它們的差異存在顯著性（P<0.001）。

3 討論

3.1 年齡增長(zhǎng)過(guò)程中股骨和腰椎最大載荷的變化

據(jù)報(bào)道，3月齡大鼠內(nèi)分泌系統(tǒng)完全發(fā)育成熟，但隨著年齡的增長(zhǎng)，在3～7月齡時(shí)大鼠的骨量陸續(xù)達(dá)到峰值，此時(shí)，皮質(zhì)骨仍在增加，而松質(zhì)骨則基本保持穩(wěn)定，變化不大[14，15]。本研究中的動(dòng)物模型恰好處在 3～7月齡峰值骨量蓄積期內(nèi)，結(jié)果顯示，大鼠股骨和腰椎最大載荷均呈現(xiàn)隨年齡增長(zhǎng)先增加后下降的顯著性變化。兩者不同的是，股骨在11周（6月齡）時(shí)達(dá)到峰值，第二腰椎在9周（5個(gè)半月齡）時(shí)達(dá)到峰值；達(dá)到峰值前，股骨的最大載荷增加較快，股骨和第二腰椎分別在C4W組（4個(gè)月零1周）和C8W組較其基礎(chǔ)對(duì)照組顯著提高。部分結(jié)果與已有文獻(xiàn)報(bào)道變化趨勢(shì)一致，但達(dá)到峰值的具體時(shí)程有一定差異[14，15]，其原因可能與股骨為長(zhǎng)形管狀骨，而三點(diǎn)彎法是在忽略股骨整體幾何形狀的前提下，對(duì)整個(gè)股骨力學(xué)性能進(jìn)行測(cè)定有關(guān)；另外實(shí)驗(yàn)條件的不同也可能構(gòu)成差異[16]。此外，本次研究結(jié)果亦與我們同期的骨量實(shí)驗(yàn)結(jié)果（對(duì)照組大鼠全身骨的峰值骨量出現(xiàn)在6.5個(gè)月）略有差異[9]。骨量增加與其力學(xué)性能提高具有一定一致性，如骨質(zhì)疏松患者骨折危險(xiǎn)性升高與骨量的大量減少分不開(kāi)，但是骨量?jī)H是骨生物力學(xué)性能四大基本特性之一，骨的質(zhì)量、骨組織結(jié)構(gòu)及微結(jié)構(gòu)完整程度的不同導(dǎo)致骨量與骨力學(xué)性能的變化并非完全同步。

表5 對(duì)照組第二腰椎最大載荷差異的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 5 Analysis for the maximum force of 2nd lumber vertebrae specimens in all control groups by one-way ANOVA

表6 運(yùn)動(dòng)組第二腰椎最大載荷差異的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 6 Analysis for the maximum force of 2nd lumber vertebrae specimens in all exercise groups by one-way ANOVA

表7 對(duì)照組與運(yùn)動(dòng)組不同實(shí)驗(yàn)周期第二腰椎最大載荷差異的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 7 Analysis for the maximum force of 2nd lumber vertebrae between control group and exercise group in every training cycle by one-way ANOVA

3.2 遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)與股骨和腰椎最大載荷變化的關(guān)系

在15周的實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)，對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組股骨和第二腰椎最大載荷均表現(xiàn)出一定的波動(dòng)性，具體表現(xiàn)為波浪式上升至最大值然后下降。但不同骨、不同組別間又存在一定的差異性。2周至6周，運(yùn)動(dòng)組股骨及第二腰椎的最大載荷均高于同期相應(yīng)對(duì)照組；9周之后股骨最大載荷逐漸低于對(duì)照組，第二腰椎則在7～8周前后即已低于同期對(duì)照組；運(yùn)動(dòng)組及對(duì)照組股骨及第二腰椎最大載荷分別在11周和9周達(dá)到峰值，但運(yùn)動(dòng)組峰值均低于對(duì)照組；除股骨T13W組高于C13W組外，股骨及第二腰椎最大載荷在達(dá)到峰值后均表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)組低于對(duì)照組。Frost的理論認(rèn)為，力學(xué)載荷對(duì)于骨骼的作用表現(xiàn)為隨著應(yīng)變?cè)黾庸堑纳L(zhǎng)相應(yīng)增加，當(dāng)應(yīng)變達(dá)到閾值后，如果負(fù)荷繼續(xù)增加，骨的生長(zhǎng)反而減少[17]。同時(shí)，我們同期的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果[9]也證實(shí)，對(duì)骨骼施加超出成骨效應(yīng)閾值范圍的負(fù)荷，會(huì)誘導(dǎo)骨骼出現(xiàn)高代謝轉(zhuǎn)換及骨吸收為主導(dǎo)的特征性變化。據(jù)此可知，本實(shí)驗(yàn)中遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)的強(qiáng)度及量度在實(shí)驗(yàn)前半時(shí)期（1～6周）對(duì)大鼠骨的生長(zhǎng)起到了促進(jìn)作用，因而表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)組最大載荷高于對(duì)照組；但當(dāng)負(fù)荷增加至一定階段（7周前后開(kāi)始）則已超出良性范疇，出現(xiàn)對(duì)負(fù)荷載體——骨骼的抑制效應(yīng)。因而，大鼠的骨形成作用相對(duì)減弱，骨量及骨質(zhì)均發(fā)生改變，而這些變化也勢(shì)必引起力學(xué)性能的相應(yīng)變化。這提示對(duì)專(zhuān)業(yè)運(yùn)動(dòng)員，合理適度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練將有助于其骨骼的成骨效應(yīng)和力學(xué)性能的提高，超負(fù)荷的過(guò)量運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練則可能導(dǎo)致相反的結(jié)果，對(duì)少年運(yùn)動(dòng)員尤其應(yīng)該注意負(fù)荷量與個(gè)體承受能力間的相互效應(yīng)關(guān)系。

已有研究表明[18]，骨質(zhì)疏松過(guò)程中最初表現(xiàn)為松質(zhì)骨的骨量下降，然后皮質(zhì)骨變薄，最終導(dǎo)致抵抗外力作用下降。本研究中，與對(duì)照組相比，腰椎最大載荷較股骨更早表現(xiàn)出下降；15周實(shí)驗(yàn)期內(nèi)運(yùn)動(dòng)組第二腰椎最大載荷與對(duì)照組有顯著性差異（P<0.001），股骨無(wú)顯著性差異。但由于壓力試驗(yàn)是對(duì)整個(gè)椎體進(jìn)行的，其中皮質(zhì)骨的比例過(guò)大而不能代表純松質(zhì)骨的力學(xué)特性，因此，在本實(shí)驗(yàn)的遞增負(fù)荷方案下，第二腰椎最大載荷的變化較股骨發(fā)生得更早、更顯著，而松質(zhì)骨的變化則需要應(yīng)用壓痕試驗(yàn)[19，20]進(jìn)一步論證。

此外，由于本研究中大鼠股骨和第二腰椎最大載荷變化發(fā)生在遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)的9～11周時(shí)段（大鼠5.5～6月齡），而我們同期的動(dòng)物模型結(jié)果亦顯示，在此時(shí)段運(yùn)動(dòng)組大鼠的全身骨密度最大[9]，由此推測(cè)5.5～6月齡可能是遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)致大鼠骨質(zhì)及骨量變化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)。

4 總結(jié)

SD大鼠骨的最大載荷隨年齡增長(zhǎng)出現(xiàn)相應(yīng)變化，表現(xiàn)為波浪式上升至一定時(shí)期開(kāi)始下降，且腰椎骨先于股骨到達(dá)峰值；遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)SD大鼠骨的最大載荷產(chǎn)生的效應(yīng)取決于運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，且腰椎較股骨更明顯。

（致謝:感謝南方醫(yī)科大學(xué)臨床解剖學(xué)研究所、廣東省醫(yī)學(xué)生物力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室歐陽(yáng)鈞主任、趙衛(wèi)東老師和梁棟柱老師在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中給予的指導(dǎo)與支持。感謝南方醫(yī)科大學(xué)孫培棟碩士、于巧蓮碩士以及劉陽(yáng)博士在實(shí)驗(yàn)期間給予的幫助。）

[1]Brewer V，Mever BM，Keele MS，et al.Role of exercise in prevention of involutional bone loss.Med Sci Sports Exer，1983，15:445.

[2]左群，于新凱，陸愛(ài)云.游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能的影響.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2007，26（2）:228-230.

[3]步斌.游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠股骨和腰椎骨生物力學(xué)性能影響的研究. 體育科學(xué)，2005，25（11）:55-57.

[4]Alcorn JD，Vyvial BA，Bloomfield SA，et al.Exercise improvesthe strength ofbone in the proximaltibia of hindlimb unloaded mature rats.J Biomechanics，2006，39（Supplement 1）:876.

[5]Drinkwater BL，Nilson K，Chesnut CH，3rd，et al.Bone mineral content of amenorrheic and eumenorrheic athletes.N Engl J Med，1984，311（5）:277-281.

[6]Nichols JF，Rauh MJ，Barrack MT，et al.Bone mineral density in female high school athletes:interactions of menstrual function and type of mechanical loading.Bone，2007，41（3）:371-377.

[7]Joy EA and Campbell D.Stress fractures in the female athlete.Curr Sports Med Rep，2005，4（6）:323-328.

[8]Braam LA，Knapen MH，Geusens P，et al.Factors affecting bone loss in female endurance athletes:a two-year follow-up study.Am J Sports Med，2003，31（6）:889-895.

[9]陳曉紅，鄭陸，王智強(qiáng).過(guò)度運(yùn)動(dòng)致骨量降低動(dòng)物模型的建造. 中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2009，28（6）:667-671.

[10]鄧紅文，劉耀中.骨生物學(xué)前沿.北京:高等教育出版社，2006.116-121.

[11]Turner CH，Burr DB.Basic biomechanical measurements of bone:a tutorial.Bone，1993，14:595-608.

[12]Bebforf TG，Tipton CM，Wilson NC，et al.Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures.J Appl Physiol，1979，47（6）:1278-1283.

[13]鄭陸，潘力平，隋波，等.運(yùn)動(dòng)性動(dòng)情周期紊亂動(dòng)物模型的建立. 山東體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，21（2）:46-49，59.

[14]劉鈺瑜.骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的研究進(jìn)展.中國(guó)臨床藥理學(xué)與理療學(xué)，2002，7（6）:570-573.

[15]Jee WSS.The aged rat model for bone biology studies.J Cells and Materials （Supplement 1），Scanning Microscope Internation，Chicago，1991:25-29.

[16]鄧雪梅，劉躍，謝力勤.不同加載速度對(duì)大鼠骨生物力學(xué)特性的影響. 中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，1999，5（1）:8，9，21.

[17]Frost HM.Strain and other mechanical influences on bone strength and maintenance.Curr Opin Orthop，1997，8:60-70.

[18]Pak CYC，Sskhaee K，Beu NH.Comparison of nonrandomized rails with slow release odium fluoride with a randomized placebo on rolled trialin postmenopausal osteoporosis.J Bone Miner Res，1996，11:160-166.

[19]章曉霜，許豪文，趙衛(wèi)東.不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)和雌激素聯(lián)合作用對(duì)去卵巢大鼠骨骼生物力學(xué)性能的影響.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2006，25（2）:187-191.

[20]杜艷艷，鄭陸，楊俊卿.壓痕試驗(yàn)法研究遞增負(fù)荷訓(xùn)練隊(duì)大鼠松質(zhì)骨生物力學(xué)性能的影響.首都體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，21（4）:457-461.