許 群,方軼萍,趙小迎

(1.溫州醫(yī)學(xué)院,2.溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 婦產(chǎn)科,浙江 溫州 325000)

巴豆系大戟科植物巴豆 Croton tiglium L.的種子,味辛,民間早已用巴豆治療腫瘤。巴豆生物堿(Croton Alkaloid,CA)是巴豆的有效成分之一。CA對(duì)甲狀腺癌、胃癌、肝癌等多種腫瘤具有治療作用[1-2],還可通過(guò)對(duì)膜系統(tǒng)分子動(dòng)力學(xué)、膜流動(dòng)性及膜蛋白、膜脂類功能等的影響,降低腫瘤細(xì)胞的惡性程度及其轉(zhuǎn)移活性,進(jìn)一步促使癌細(xì)胞逆轉(zhuǎn)[3]。已有研究證明,巴豆煎液對(duì)人正常淋巴細(xì)胞影響輕微,而對(duì)HL-60細(xì)胞具有較強(qiáng)殺傷作用,對(duì)細(xì)胞毒性具有較強(qiáng)的選擇性[4]。本文旨在研究 CA對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的作用,并初步探討其抗腫瘤的機(jī)理。

1 材 料

人宮頸癌 Hela細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。CA(浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室提取制備);RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone公司);胰蛋白酶、胎牛血清(四季青公司);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT,Sigma公司);AnnexinV-PI凋亡檢測(cè)試劑盒(Becton Dickinson公司);Caspase-8活性檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所);Caspase-8(Biolegend公司);RNA提取試劑盒 Trizol Reagent(華美生物工程公司);DNA Marker(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司);RT-PCR試劑盒(Promega公司)。

引物由上海生工基因技術(shù)有限公司合成,Caspase-8引物擴(kuò)增產(chǎn)物為426 bp,β-actin為500 bp。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)復(fù)蘇凍存的Hela細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,加入雙抗青霉素和鏈霉素(終濃度均為100 u/mL),37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)松蓋培育。每?jī)商鞊Q液一次,細(xì)胞融合達(dá) 80%～90%時(shí),以0.25%胰蛋白酶消化、傳代。

2.2 MTT法

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以6.0×104個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔 100μL,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后棄上清,加入含有不同濃度 CA(50,100,200μg/mL)的培養(yǎng)基,每一濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔,每板設(shè)6個(gè)復(fù)孔的空白對(duì)照,分別培養(yǎng)24,48 h后取板備測(cè)。將備測(cè)孔依次加入5mg/mL MTT溶液10μL,入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清,每孔加入二甲基亞砜 100μL,平板振蕩器上振蕩 8～10 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次,取平均值。抑制率(IR)=(1-A試驗(yàn)/A對(duì)照)×100%。

2.3 AnnexinV-PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

用RPMI 1640培養(yǎng)液將 Hela細(xì)胞制成3×105/mL濃度接種于24孔板中,每孔加入細(xì)胞懸液1mL,每種細(xì)胞分成4組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 24,48 h,收集每孔細(xì)胞于小離心管中離心,用結(jié)合緩沖液洗一次,每孔細(xì)胞懸于100μL結(jié)合液中,加入FTTC-AnnexinⅤ和PI溶液各 5μL,混勻后避光室溫放置15 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。Beckman Coulter protocol軟件分析。其中AnnexinV+PI-為凋亡細(xì)胞,AnnexinV+PI+為壞死細(xì)胞。

2.4 RP-PCR檢測(cè) Caspase-8mRNA的表達(dá)

在25mL培養(yǎng)瓶中以1×106/mL的密度接種Hela細(xì)胞,正常對(duì)照組(僅加培養(yǎng)基培養(yǎng)),設(shè)置藥物劑量梯度(CA 50,100,200μg/mL),培養(yǎng)12 h后取出備用。用Trizol Reagnt試劑盒提取各組細(xì)胞的總 RNA,再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),最后將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 cDNA進(jìn)行 PCR反應(yīng)。β-actin:上游引物:5′-ATGGATGATGATATCGCCGCG-3′;下游引物:5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATG-3′。Caspase-8上游引物:5′-TCTGGAGCATCTGCTGTCTG-3′;下游 引 物:5′-CCTGCCTGGTGTCTGAAGTT-3′。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)Gel-ProAnalyzerVersion 3.0凝膠成像系統(tǒng)存儲(chǔ)圖象并分析結(jié)果,以Caspase-8與βactin基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的吸光度比值,表示Caspase-8的相對(duì)表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 MTT法

不同濃度 CA作用于人宮頸癌 Hela細(xì)胞后,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著抑制作用。且隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加,抑制率增高,表現(xiàn)為時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。不同作用時(shí)間相同濃度相比,除 CA濃度為50mg/L作用24和48 h之間,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)外,其余實(shí)驗(yàn)組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表1)。

3.2 不同濃度 CA在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)Hela細(xì)胞凋亡率的影響

結(jié)果見(jiàn)表2及圖1。CA作用后Hela細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較,差異顯著(P＜0.05),且呈與作用時(shí)間和濃度成正比。不同作用時(shí)間相同濃度相比差異顯著(P＜0.05),不同濃度相同作用時(shí)間相比差異顯著(P＜0.05)(表2)。

表1 巴豆生物堿對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用(n=3,±s)Tab.1 The proliferation inhibition of Croton alkaloids on Hela cells(n=3,±s)

表1 巴豆生物堿對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用(n=3,±s)Tab.1 The proliferation inhibition of Croton alkaloids on Hela cells(n=3,±s)

與對(duì)照組比較:1P＜0.05;與24 h比較:2P＜0.05;組間兩兩比較:3 P＜0.05Compared with control group:1 P＜0.05;Compared with 24 h:2P＜0.05;Interclass paired comparison:3 P＜0.05

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表2 巴豆生物堿對(duì)Hela細(xì)胞凋亡率的影響(n=3,±s)Tab.2 The cell apoptosis of Croton alkaloids on Hela cells(n=3, ±s)

表2 巴豆生物堿對(duì)Hela細(xì)胞凋亡率的影響(n=3,±s)Tab.2 The cell apoptosis of Croton alkaloids on Hela cells(n=3, ±s)

與對(duì)照組比較:1 P＜0.05;與24 h比較:2P＜0.05;組間兩兩比較:3 P＜0.05Compared with control group:1P＜0.05;Compared with 24h:2P＜0.05;Interclass paired comparison:3 P＜0.05

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圖1 不同濃度巴豆生物堿作用48h后Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphologic changes of Hela cells treated with Croton alkaloids

3.3 Caspase-8試劑盒檢測(cè) CA對(duì)Hela細(xì)胞Caspase-8活性的影響

結(jié)果見(jiàn)表3和圖2。經(jīng)CA作用48 h后,Hela細(xì)胞Caspase-8活性明顯上調(diào),與對(duì)照組比較差異顯著,且不同濃度 CA之間兩兩比較差異顯著(P＜0.05)。

表3 巴豆生物堿作用48 h后對(duì)Caspase-8活性的影響(n=9,±s)Tab.3 Caspase-8 activity assay before and after 48 hours Croton alkaloids treatment of Hela cells(n=9,±s)

表3 巴豆生物堿作用48 h后對(duì)Caspase-8活性的影響(n=9,±s)Tab.3 Caspase-8 activity assay before and after 48 hours Croton alkaloids treatment of Hela cells(n=9,±s)

與對(duì)照組比較:1 P＜0.05;組間兩兩比較:2P＜0.05Compared with control group:1P＜0.05;Interclass paired comparison:2P＜0.05

組別 劑量/(μg/mL) Caspase-8活性(A實(shí)驗(yàn) /A空白)對(duì)照組 - 5.98±0.13巴豆生物堿組 50 10.67±0.311 100 12.38±0.421,2 200 13.89±0.181,2

圖2 不同濃度巴豆生物堿作用24 h后對(duì)Hela細(xì)胞凋亡率的影響Fig.2 The cell apoptosis on Hela cells after 24h treatment with Croton alkaloids

3.4 RT-PCR檢測(cè) CA作用下Hela細(xì)胞Caspase-8表達(dá)的影響

Hela細(xì)胞經(jīng)CA作用12 h后,采用RT-PCR方法,分析 Caspase-8mRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物與β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶的吸光度比值,反映目的基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,經(jīng)不同濃度 CA處理12 h后Caspase-8表達(dá)水平明顯升高,見(jiàn)圖3。

圖3 RT-PCR檢測(cè) Caspase-8mRNA的變化Fig.3 RT-PCR analysis of caspase-8mRNA of Hela cells treated with Croton alkaloids

4 討 論

本研究采用不同劑量的CA對(duì)人子宮頸癌 Hela細(xì)胞作用24,48 h,經(jīng)MTT檢測(cè),抑制率隨藥物濃度和作用時(shí)間的增加而增高,并且表現(xiàn)為時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。另外本研究 AnnexinV-PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡率隨時(shí)間和劑量的增加而逐漸增強(qiáng),200μg/mL CA作用48 h后,細(xì)胞凋亡率達(dá)10.10%。進(jìn)一步證實(shí) CA作用后的Hela細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的改變,推測(cè) CA在體外是通過(guò)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抗腫瘤作用。

本研究通過(guò) Caspase-8活性檢測(cè)試劑盒和半定量 RT-PCR技術(shù)檢測(cè) CA對(duì)Hela細(xì)胞Caspase-8蛋白活性和Caspase-8mRNA表達(dá)水平的變化,進(jìn)一步證實(shí) CA通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào) Caspase-8mRNA的表達(dá)、激活 Caspase-8的活性而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但是Caspase-8通過(guò)何種途徑被上調(diào),又是通過(guò)何種信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮其作用的,還有待進(jìn)一步研究。

[1]劉秀德,隋在云.巴豆總生物堿對(duì)癌細(xì)胞質(zhì)膜流動(dòng)性及胞漿基質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響[J].山東中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1995,19(3):192-194.

[2]徐立生.巴豆生物堿治療胃癌 128例臨床觀察[J].中華腫瘤雜志,1992,14(5):392.

[3]徐立生,曲長(zhǎng)芝,馬志銓,等.抗癌藥物巴豆生物堿、順鉑對(duì)紅細(xì)胞膜的作用[J].中華腫瘤雜志,1995,17(2):115-117.

[4]徐建國(guó),馬俊英,楊貴生,等.巴豆煎液對(duì)人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究[J].中華血液學(xué)雜志,1990,11(10):538-539.