徐小峰,徐 玲,陳文萍,夏春偉

(南京市胸科醫(yī)院 呼吸科,江蘇 南京,210029)

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一,發(fā)病率及死亡率在我國均呈上升趨勢(shì),預(yù)計(jì)到 2025年,我國肺癌患者將達(dá)到 100萬,成為世界第一肺癌大國[1]。非小細(xì)胞肺癌(Non small-cell lung cancer,NSCLC)約占全部肺癌的85%,多數(shù)患者在確診時(shí)已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,失去了根治性手術(shù)的機(jī)會(huì)。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴血管和淋巴管的生成,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是刺激惡性腫瘤血管形成的重要生長因子;血管內(nèi)皮生成因子 C(VEGF-C)可以通過選擇性的淋巴管生成,促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移播散[2]。近年來體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),沙利度胺(反應(yīng)停,Thalidomide)具有免疫調(diào)節(jié)和抗血管生成作用,目前臨床已用于治療漿細(xì)胞腫瘤,對(duì)某些實(shí)體瘤如腎癌、前列腺癌等也有一定療效,但其作用機(jī)制尚無定論。本研究旨在觀察沙利度胺對(duì)NSCLC細(xì)胞株 A549體外增殖及VEGF和VEGF-C表達(dá)的影響,探討沙利度胺抗腫瘤作用的可能機(jī)制及其用于治療 NSCLC的可行性。

1 材 料

沙利度胺,Sigma公司;Trizol液及MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶,日本 TOYOBA公司;PCR MasterMix試劑盒,美國 Promega公司;鼠抗人 VEGF和VEGF-C多克隆抗體,晶美生物公司;BCIP/NBT顯色試劑盒、RAPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒,碧云天生物技術(shù)研究所。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

A549細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤所分子生物學(xué)檢測(cè)中心提供。

MCO-15AC CO2恒溫培養(yǎng)箱,日本 SANYO;酶標(biāo)儀、DY-III8型電泳儀,北京六一儀器廠;PE-9600 PCR基因擴(kuò)增儀,美國 PE公司;凝膠成像系統(tǒng),英國 UVB公司。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

A549細(xì)胞貼壁生長于含10%胎牛血清,100 u/L青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)良好無退化,每3～4 d傳代一次,隔日換液,取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和沙利度胺 5,10,20,40,60mg/L劑量組。沙利度胺以無菌的二甲亞砜(DMSO)溶解并配制成20mg/mL的貯存液,臨用時(shí)用DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

將對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,接種于96孔板,細(xì)胞密度為1×104/mL,過夜。次日取出培養(yǎng)板,加入不同濃度沙利度胺 20μL,每孔總體積為200μL,每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,并設(shè)置含0.5%DMSO的DMEM培養(yǎng)液替代實(shí)驗(yàn)用藥物作為空白對(duì)照,繼續(xù)培養(yǎng)24,48和72 h,取出培養(yǎng)板,每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL,置37℃,4 h,取出培養(yǎng)板,棄去培養(yǎng)液,每孔加入DMSO 150μL,充分震蕩混勻 10 min后,置酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長處吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次,取平均值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)/A空白對(duì)照)×100%。

2.3 RT-PCR半定量檢測(cè)相關(guān)基因 mRNA表達(dá)水平

Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄體系為20μL:細(xì)胞總RNA3μL(2.5～3 μg),10 U/μL RNAsin 1μL,5×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4μL,10μmol/LdNTP 2μL,25 pmol/μL隨機(jī)引物1μL,MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶 100 U,25 mmol/LmgCl20.5μL。30℃反應(yīng)10 min,42℃反應(yīng)20 min,99℃ 5 min終止反應(yīng)。所用VEGF和VEGF-C及內(nèi)參照GAPDH引物均由上海生工公司合成。VEGF引物(擴(kuò)增產(chǎn)物583bp):上游為5′-CGAAACCATGAACTTTCTGCTGTC-3,下游為5′-TCACCGCCTCGGCTTGTCACAT-3′。VEGFC引物 (擴(kuò)增產(chǎn)物 462 bp):上游為5-GGCCCCAAACCAGTAACAATC-3′;下游為5′-GGGGCAGGTTCTTTTACATACAC-3′。GAPDH引物(擴(kuò)增產(chǎn)物 306 bp):上游為5′-CGGAGTCAACGGATTGGTCGTAT-3′;下游為5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。PCR體系為:逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL(0.1～2μg),10 pmol/μL上、下游引物各2.5μL,PCR Master Mix 12.5μL,其余以無核酶水補(bǔ)足至25μL。擴(kuò)增條件:95℃ 30 s,56℃30 s,72℃45 s,共35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳(80V,35min)后,紫外透射儀下觀察并照相,在凝膠上進(jìn)行掃描定量,以目的基因與內(nèi)參照的熒光比值代表 mRNA的表達(dá)水平。

2.4 Western-blot方法檢測(cè) VEGF和VEGF-C蛋白水平的表達(dá)

用RAPA裂解液裂解各組細(xì)胞提取總蛋白,采用BCA法測(cè)定各組總蛋白濃度,制備 10%SDSPAGE,每泳道加總蛋白100μg,進(jìn)行電泳,經(jīng)濕轉(zhuǎn)印到 PVDF膜上(美國 Amresco公司),5%BSATBST常溫下封閉1h,分別加入鼠抗人 VEGF和VEGF-C及GAPDH多克隆抗體(1∶50稀釋),4℃孵育過夜,然后加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠 IgG(1∶1 000稀釋),37℃孵育 1 h,TBST洗滌,BCIP/NBT顯色試劑盒顯影,拍照保存,Gel-Pro Analyzer分析軟件計(jì)算 VEGF和VEGF-C相對(duì)含量,即 TGF-β/GAPDH和PCNA/GAPDH灰度比值。每組重復(fù) 3次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 不同質(zhì)量濃度的沙利度胺對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制的影響

各組細(xì)胞的的增殖抑制率見表1,不同質(zhì)量濃度的沙利度胺作用于A549細(xì)胞24 h后,細(xì)胞呈不同程度的增殖抑制,組間兩兩比較分析結(jié)果顯示,隨著沙利度胺質(zhì)量濃度的增高,A549細(xì)胞的增殖抑制率增高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),沙利度胺對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制呈濃度依賴性。

3.2 沙利度胺對(duì)A549細(xì)胞VEGF和VEGF-C mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響

表1 不同質(zhì)量濃度的沙利度胺作用于A 549細(xì)胞的增殖抑制率比較(n=3,±s)Tab.1 The growth inhibiting of A 549 cells after interfered by mass concentration of thalidomide(n=3,±s)

表1 不同質(zhì)量濃度的沙利度胺作用于A 549細(xì)胞的增殖抑制率比較(n=3,±s)Tab.1 The growth inhibiting of A 549 cells after interfered by mass concentration of thalidomide(n=3,±s)

組間兩兩比較:1 P＜0.05Interclass paired comparison:1P＜0.05

組別 劑量/(mg/L) A值 抑制率/%對(duì)照組 - 0.742±0.054 -沙利度胺組 5 0.650±0.032 12.40±1.06 10 0.571±0.053 23.05±0.761 20 0.507±0.047 31.66±0.911 40 0.482±0.033 36.42±0.661 60 0.453±0.036 38.94±1.191

RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示,各組均可檢測(cè)到 VEGF和VEGF-C mRNA和蛋白水平的表達(dá)。不同質(zhì)量濃度的沙利度胺作用于A549細(xì)胞24 h后,VEGF和VEGF-CmRNA和蛋白水平的表達(dá)呈不同程度的下降趨勢(shì)(見表2),與對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。組間兩兩比較分析結(jié)果顯示,隨著沙利度胺質(zhì)量濃度的增高,A549細(xì)胞的VEGF和VEGF-CmRNA和蛋白水平的表達(dá)下降,沙利度胺對(duì)A549細(xì)胞VEGF和VEGF-C mRNA和蛋白水平的表達(dá)抑制作用呈濃度依賴性(P＜0.05)。

圖1 各組A549細(xì)胞VEGF和VEGF-C mRNA表達(dá)水平Fig.1 The mRNA expression level of VEGF and VEGF-C in A549 cells

表2 各組A549細(xì)胞VEGF和VEGF-C mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況(n=3,±s)Tab.2 The mRNA and protein level expressions of VEGF and VEGF-Cin every group(n=3,±s)

表2 各組A549細(xì)胞VEGF和VEGF-C mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況(n=3,±s)Tab.2 The mRNA and protein level expressions of VEGF and VEGF-Cin every group(n=3,±s)

與對(duì)照組比較:1P＜0.05;組間兩兩比較:2 P＜0.05Compared with control group:1 P＜0.05;Interclass paired comparison:2P＜0.05

組別 劑量/(mg/L)mRNA的表達(dá)水平VEGF/GAPDH VEGF-C/GAPDH Western-blot灰度比值VEGF/GAPDH VEGF-C/GAPDH對(duì)照組 - 0.599±0.082 0.613±0.057 0.305±0.017 0.412±0.051沙利度胺組 5 0.546±0.0371 0.577±0.1061 0.293±0.0451 0.397±0.0931 10 0.483±0.0231,2 0.528±0.0891,2 0.274±0.0391,2 0.371±0.0821,2 20 0.294±0.0471,2 0.457±0.0651,2 0.227±0.101,2 0.305±0.0971,2 40 0.185±0.0231,2 0.397±0.0911,2 0.192±0.081,2 0.253±0.1041,2 60 0.067±0.0741,2 0.213±0.0761,2 0.153±0.091,2 0.218±0.0761,2

4 討 論

沙利度胺是一種谷氨酸衍生物,最初用于治療早孕反應(yīng)和鎮(zhèn)靜催眠,后因其嚴(yán)重的致畸作用而被禁用[3]。20世紀(jì) 90年代,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)沙利度胺具有抑制血管生成作用而應(yīng)用于漿細(xì)胞腫瘤的治療,目前也應(yīng)用于某些實(shí)體瘤,如腎癌、前列腺癌等。本研究發(fā)現(xiàn),沙利度胺體外能抑制人 NSCLC細(xì)胞株A549細(xì)胞的增殖,并隨著沙利度胺質(zhì)量濃度的增加,細(xì)胞增殖抑制作用增強(qiáng),呈濃度依賴性。劉如等[4]的研究也證實(shí)沙利度胺能夠抑制人鼻咽癌細(xì)胞株 CNE-2細(xì)胞增殖,呈濃度依賴性。

腫瘤血管生成受多種因子的調(diào)控,如血管生成因子,細(xì)胞因子及其抑制因子等。VEGF家族由VEGF-A(或 VEGF)、B、C、D、E和胎盤生長因子(Placenta growth factor,PIGF)等組成,這些因子均與血管生成有關(guān)。其中VEGF可能是最強(qiáng)的促血管生成因子,對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、水解基膜、遷移和血管構(gòu)建的調(diào)控作用較強(qiáng),還可誘導(dǎo)腫瘤淋巴管形成,是淋巴管轉(zhuǎn)移的原因之一[5]。沙利度胺可以抑制肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)[6]。VEGF-C也具有誘導(dǎo)新生血管生成的作用,而且在淋巴管系統(tǒng)發(fā)育中起重要調(diào)節(jié)作用[7]。沙利度胺可特異性抑制VEGF-C,能阻斷腫瘤的血管生成和淋巴管生成,削弱腫瘤的淋巴管轉(zhuǎn)移[8]。本研究結(jié)果表明,經(jīng)不同質(zhì)量濃度的沙利度胺作用24 h,VEGF和VEGF-C mRNA和蛋白水平的表達(dá)均不同程度的下降,呈濃度依賴性模式,即隨著沙利度胺質(zhì)量濃度的增加,VEGF和VEGF-C mRNA和蛋白水平的表達(dá)下降。沙利度胺可能通過下調(diào) A549細(xì)胞中 VEGF和VEGF-C的表達(dá),從而抑制腫瘤血管和淋巴管的生成,最終達(dá)到抗腫瘤的作用。

綜上所述,沙利度胺體外對(duì)NSCLC細(xì)胞株A549具有生長抑制作用,其作用機(jī)制可能通過下調(diào)A549細(xì)胞中 VEGF和VEGF-C的表達(dá),從而抑制腫瘤血管和淋巴管的生成,最終達(dá)到抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的作用。本研究為臨床應(yīng)用沙利度胺治療肺癌提供了一定的理論依據(jù),以VEGF和VEGF-C及其受體為靶點(diǎn)的治療,可能成為NSCLC潛在的治療策略。

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