楊兵 陳炯

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院普通外科 安徽 合肥 230001)

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,惡性程度極高,預(yù)后極差。在腫瘤病理中,細胞對低氧的適應(yīng)和血管生成是腫瘤發(fā)展過程中的關(guān)鍵步驟之一。本研究通過采用RT-PCR及免疫組織化學(xué)染色的方法檢查胰腺癌及正常人類胰腺組織中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1(glucose transporter-1,Glut-1)的表達,探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

胰腺癌組:我院普外科2000年1月至2008年10月間手術(shù)切除的30例胰腺癌標本;正常組:20例正常胰腺組織來源于同期良性胰腺腫瘤切除距腫瘤邊緣2cm的正常組織,所有標本均在手術(shù)切除后迅速凍存于液氮中,然后置于-80℃低溫保存。全部病例術(shù)前均未行放、化療,術(shù)后均經(jīng)病理檢查證實。

1.2 主要試劑

免疫組化SP試劑盒,兔抗人抗體Glut-1、VEGF購自北京博奧森公司;Trizol試劑購自美國invitrogen公司。MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及TaqDNA聚合酶均購自美國Promega公司;Glut-1、VEGF和βactin引物序列由上?！吧ぁ惫竞铣?由Primer.5.0軟件設(shè)計,其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。免疫組化按試劑盒說明書操作。

1.3 RT-PCR檢測

樣品總RNA的制備:取組織50mg,采用Trizol說明書提取其中的總RNA。紫外分光光度計檢測其濃度和純度后,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA的合成:反應(yīng)體系中加入提取的RNA5μg,2.5mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)4μL,寡聚脫氧胸苷酸0.3μg,RNA酶抑制劑20U,0.1mol/L巰基乙醇25μL,加水至19μL。上述混合物70℃加熱5min后,冰上冷卻,然后加入MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶5μL,終體積25μL,離心、混勻后37℃水浴60min,最后90℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶活性,冰上冷卻后即完成cDNA的合成。利用PCR方法擴增模板cDNA,預(yù)變性:94℃ 5min,變性:92℃ 30s,退火:63℃ 30s,延伸:72℃ 45s。循環(huán)次數(shù):35次,后延伸:72℃ 7min。VEGF:上游引物序列5'-GGAGCTTCAGGACATTGCTGTG-3'下游引物序列5'-GGAGGAAGGTCAACCACTCAC-3',目的片段長度為353 bp,Glut-1上游引物序列5'-TCATCGTGGCTGAACTCTTCAG-3'下游引物序列5'-TCACACTTGGGAATCAGCCCC-3',目的片段長度為231bp.β-actin上游引物序列為:5'-ACC ACA GTCCAT GCC ATC AC-3',下游序列為:5'-TCC ACC ACC CTGTTG CTG TA-3',目的片段長度為619 bp,反應(yīng)完畢后,產(chǎn)物取2μL行凝膠電泳。目的基因和內(nèi)參標基因(β-actin)PCR產(chǎn)物用凝膠電泳分離,每條帶特異片斷的相對量用DR2000凝膠圖像分析系統(tǒng),在紫外燈下對凝膠圖像進行掃描后處理數(shù)據(jù),Marker對照。以目的基因條帶光密度值與β-actin條帶光密度值作為目的基因在胰腺組織和胰腺癌組織中表達的相對強度。

表1 Glut-1 mRNA、VEGF mRNART-PCR產(chǎn)物光密度測量結(jié)果()

表1 Glut-1 mRNA、VEGF mRNART-PCR產(chǎn)物光密度測量結(jié)果()

注:與正常組比較*P<0.01

表2 Glut-1、VEGF免疫組化結(jié)果()

表2 Glut-1、VEGF免疫組化結(jié)果()

注:與正常組比較，*P<0.01

1.4 免疫組化法檢測蛋白的表達

胰腺組織石蠟切片Glut-1、VEGF免疫組織化學(xué)染色。每例均隨機觀察10個高倍視野,讀取陽性細胞數(shù)。由兩位病理科醫(yī)師雙盲閱片。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,所有計量資料均以（）表示。2個樣本均數(shù)間比較用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Glut-1 mRNA、VEGF mRNA在組織中表達結(jié)果

1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,正常組Glut-1 mRNA、VEGF mRNA產(chǎn)物電泳條帶暗、產(chǎn)量低;胰腺癌組產(chǎn)物條帶強、產(chǎn)量高,其光密度值與正常組相比明顯增高(P＜0.01)。結(jié)果見表1。

2.2 Glut-1、VEGF的免疫組化結(jié)果

正常組個別細胞胞漿和/或胞膜內(nèi)Glut-1、VEGF弱陽性表達;胰腺癌組細胞胞漿和/或胞膜內(nèi)Glut-1、VEGF陽性表達與正常組相比顯著增加(P＜0.01),在胰腺癌壞死組織周圍的癌細胞中表達更強,結(jié)果見表2。

3 討論

本研究結(jié)果顯示胰腺癌組織Glut-1 mRNA、VEGF mRNA水平明顯高于正常組織(P<0.01),且Glut-1的表達與VEGF的表達呈正相關(guān)性。結(jié)果說明Glut-1作為VEGF的靶基因產(chǎn)物,由于胰腺癌對能量需求的增加刺激VEGF mRNA增多,使VEGF表達上調(diào),結(jié)果表現(xiàn)為胰腺癌血管生成,癌細胞能量供應(yīng)充足,癌細胞攝取葡萄糖加強,刺激Glut-1 mRNA增多,最終導(dǎo)致Glut-1的表達增加。

本研究結(jié)果提示Glut-1、VEGF在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,為今后以Glut-1、VEGF為靶點的臨床基因治療和預(yù)防胰腺癌提供新的重要對策。

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