于 芳 張安民 胡淑萍

(1.中北大學體育系,山西太原 030051;2.煙臺大學體育學院,山東煙臺 264005;3.山西財經(jīng)大學校醫(yī)院,山西太原 030006)

不同游泳訓練對下丘腦室旁核c-fosmRNA表達影響的實驗研究

于 芳1張安民2胡淑萍3

(1.中北大學體育系,山西太原 030051;2.煙臺大學體育學院,山東煙臺 264005;3.山西財經(jīng)大學校醫(yī)院,山西太原 030006)

觀察大鼠持續(xù)訓練、間歇訓練對大鼠下丘腦室旁核(PVN)c-fosmRNA表達的影響。大鼠持續(xù)訓練、間歇訓練對大鼠PVN中c-fosmRNA表達有影響,具有時效性,其機制可能與下丘腦產(chǎn)生的促皮質(zhì)激素釋放激素(CRF)和促皮質(zhì)激素釋放激素受體(CRFR1)分布有關(guān)。

持續(xù)訓練;間歇訓練;下丘腦室旁核;c-fosmRNA;大鼠

下丘腦不僅是內(nèi)分泌調(diào)控中樞,還是植物性神經(jīng)中樞。神經(jīng)內(nèi)分泌反應是應激的重要過程,它與下丘腦神經(jīng)元的活動密切相關(guān)。已有研究證實,應激可引起下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌功能發(fā)生改變,這種變化與應激的強度和持續(xù)時間密切相關(guān),表現(xiàn)為下丘腦各神經(jīng)核團的活動的改變,其中應激引起的腦內(nèi)核團即刻早期基因的表達變化,可做為機體應激反應的評價指標之一[1]。c-fos蛋白表達屬于即刻早期基因(IEG),它通常處于不活動或表達很低的狀態(tài),在受到刺激時能做出迅速而短暫的反應(刺激后數(shù)十分鐘內(nèi)即開始表達,數(shù)十小時后就恢復正常水平),被認為是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)最有代表性的即刻早期基因[2、3]。不同的軀體、心理應激(如冷應激、束縛應激)均可促使腦內(nèi)c-fos的廣泛表達[4]。下丘腦室旁核(PVN)是HPA軸活動的直接控制部位[5],是整合應激反應的活化中樞,但其對運動應激的反應機制尚不明確。本研究以c-fosmRNA作為應激指標,對不同形式游泳訓練后大鼠PVN內(nèi)c-fosmRNA表達的分布特點、隨時間變化的規(guī)律及其可能機制進行了研究,探討不同形式游泳訓練腦變化的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組

采用雄性SD大鼠(山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供),3月齡,體重220-250g。飼養(yǎng)條件:分籠飼養(yǎng),每籠5只,自由飲食,自然晝夜節(jié)律光照,室溫在20±5℃。相對濕度在40%-60%。將大鼠隨機分為:對照組5只,持續(xù)訓練組25只,間歇訓練組25只。

1.2 訓練模型建立

采用游泳訓練方式建立訓練動物模型。游泳條件:塑鋼玻璃游泳池,150×60×70cm,水深為大鼠身體長度的2倍,約60cm,水溫保持在33℃至36℃之間,每個游泳池隨機分配5只大鼠。正式訓練前訓練組大鼠進行3天適應性游泳訓練,三天的訓練時間分別為15min、20min、30min。隨后開始正式的游泳訓練,訓練安排見表1。

表1 游泳訓練安排

1.3 體重測量

采用HD-2006B天平,對大鼠的體重進行全程測量。開始運動前進行測量一次,然后每周一運動前對所有大鼠進行體重測量,記錄,便于統(tǒng)計分析。

1.4 取材

6周持續(xù)游泳訓練造模結(jié)束后,分即刻、30min、60min、120min、240min五個時刻取材。每個時刻隨機取五只大鼠,首先用0.2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉動物(35-50mg/kg體重),迅速斷頭,將頭部放在冰盤上,打開顱腔,暴露全腦,取出全腦。

1.5 提取 RNA

從全腦中取50-100mg下丘腦樣品置于液氮預冷的研缽中,研磨期間不斷加入液氮,成粉末狀(加 RNAISO REAGENT至樣品完全覆蓋),室溫靜置5min,高速離心5min(12000轉(zhuǎn)、4℃),取上清,移入新離心管,然后加入 1/5 RNAISO REAGENT體積量的氯仿(振蕩混勻,蓋緊擰,呈乳白狀),室溫靜置5min,高速離心15min,(12000轉(zhuǎn)4℃,三相),然后取上清移至新的離心管中,加入與上清等體積異丙醇(上下?lián)u混勻)。室溫靜置 10min,高速離心10min(12000轉(zhuǎn)、4℃),棄上清,在下面的沉淀中加1mL75%乙醇(上下?lián)u混勻)高速離心15min(12000轉(zhuǎn)、4℃),室溫干燥4min,適量DEPC處理水20μl溶解 RNA,必要時移液槍吹打,取樣本5μl用于下步反應,余置-80℃超低溫冰箱中保存。全過程均在無RNA酶條件下進行;PCR產(chǎn)物分析取擴增產(chǎn)物8μl加上樣液2μl在2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物(80V、60min),溴化乙錠(EB)染色,用凝膠成像系統(tǒng)成像拍照并半定量分析。計算出PCR產(chǎn)物密度含量。用c-fos基因擴增產(chǎn)物的光密度與B-actin基因擴增產(chǎn)物的光密度比值,表示c-fosmRNA的表達水平。

1.6 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,應用spss13.0統(tǒng)計軟件進行單因素設計方差分析,結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學意義時,進一步行多重比較的LRS檢驗,P＜0.05檢驗為差異有顯著性意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同游泳運動方式對大鼠體重的影響

表2顯示不同游泳運動方式對大鼠體重影響很大。在訓練前對照組大鼠體重與間歇組、持續(xù)組相比無顯著差異(P＞0.05),大鼠游泳運動一周后,體重開始發(fā)生變化,對照組大鼠體重隨時間而逐漸增加,間歇組大鼠體重略有增長,但組間無顯著性差異;持續(xù)組大鼠體重在第三周下降較為明顯,隨后保持穩(wěn)定;間歇組、持續(xù)組大鼠體重均低于對照組,且具有非常顯著性差異(P＜0.001)。

表2 游泳訓練后大鼠體重分析結(jié)果

2.2 大鼠持續(xù)、間歇游泳訓練后PVN內(nèi)c-fosm RNA基因表達的時程變化

圖1、2及表3得出如下結(jié)果:c-fosmRNA在正常對照組和模型組大鼠下丘腦內(nèi)均有表達,對照組c-fosmRNA表達較低,模型組c-fosmRNA明顯增多,與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05);持續(xù)訓練結(jié)束后,大鼠PVN c-fosmRNA表達持續(xù)升高,訓練后 120min達到峰值,較即刻、30min、240min表達顯著升高(P＜0.05),240min后表達下降;間歇訓練結(jié)束后,大鼠PVN c-fosmRNA表達逐步升高,120min達到峰值,較其它各組顯著升高(P＜0.05),而后回落;運動結(jié)束后即刻、120min時間點間歇訓練組大鼠PVN中c-fosmRNA表達高于持續(xù)訓練組,30min、60min時間點大鼠PVN中cfosmRNA表達低于持續(xù)訓練組,兩兩比較統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)在30min、60min、120min,兩組間存在顯著性差異(P＜0.05)。

圖1 各組大鼠下丘腦c-fosm RNA表達

表3 游泳訓練后大鼠PVN中c-fosm RNA分析結(jié)果

圖2 大鼠下丘腦c-fosm RNA表達時程圖

3 結(jié)論

在原癌基因的家族中有一類能被第二信使所誘導的原癌基因稱為即刻早期基因(Immediately Early Genes,IEGs),亦稱快速反應基因。這類基因是指細胞經(jīng)外部刺激后最先表達的一組基因,是聯(lián)系細胞生化改變與細胞最終對刺激發(fā)生特異性反應的中介物。因此,又被認為是第三信使[6]。cfos屬于即刻早期基因(IEG),近幾年來,隨著對生物學功能認識的逐漸深入,人們開始從不同的角度探討影響原癌基因c-fos表達的因素。c-fos基因作為數(shù)十種原癌基因中的一種,在正常情況下參與細胞的生長、分化、信息傳遞、學習和記憶等生理過程,它通常處于不活動或表達很低的狀態(tài),在受到刺激時能做出迅速而短暫的反應(刺激后數(shù)十分鐘內(nèi)即開始表達,數(shù)十小時后就恢復正常水平),被認為是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)最有代表性的即刻早期基因[2、3],且其表達產(chǎn)物mRNA和核磷蛋白(P55c-fos,簡稱Fos)位于神經(jīng)元的胞漿或胞核內(nèi),人們常將其視作神經(jīng)元激活的一個重要指標。再之,不同性質(zhì)和強度刺激時c-fos表達的腦區(qū)、時程、密度和數(shù)量不同,用免疫組織化學方法顯示在各種刺激條件下cfos表達產(chǎn)物所在腦區(qū)和強度并結(jié)合其時程變化的特點,可對不同刺激在腦內(nèi)的功能定位和神經(jīng)通路進行研究[7]。短暫的刺激與長期的表達變化有著一定的聯(lián)系,這其中需要原癌基因表達的改變,同時也必然存在著一種或多種機制,將細胞表面刺激與神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)裝置偶聯(lián)起來,從而對細胞分化和可塑性起著重要作用。近期不少學者注意到了這一點,開始研究應激對下丘腦c-fos蛋白表達的影響。

本研究建立了持續(xù)訓練、間歇訓練實驗動物模型,用持續(xù)訓練模擬強度低、有節(jié)奏、持續(xù)時間較長的有氧運動;用間歇訓練模擬負荷強度高、瞬間性強的無氧運動。選取下丘腦室旁核為研究腦區(qū),觀察持續(xù)訓練、間歇訓練后,大鼠下丘腦室旁核c-fosmRNA表達規(guī)律,探討不同形式訓練腦變化的可能機制。實驗結(jié)果顯示:持續(xù)、間歇訓練后大鼠下丘腦PVN中c-fos陽性細胞表達均顯著升高。其規(guī)律是:持續(xù)訓練結(jié)束后,大鼠 PVN c-fos mRNA表達持續(xù)升高,訓練后120min達到峰值,較即刻、30min、240min表達顯著升高(p＜0.05),240min后表達下降;間歇訓練結(jié)束后,大鼠PVN c-fosm-RNA表達逐步升高,120min達到峰值,較其它各組顯著升高(p＜0.05),而后回落;運動結(jié)束后即刻、120min時間點間歇訓練組大鼠 PVN中c-fosmRNA表達高于持續(xù)訓練組,30min、60min時間點大鼠 PVN中c-fosmRNA表達低于持續(xù)訓練組,兩兩比較統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)在30min、60min、120min,兩組間存在顯著性差異(P＜0.05)。這些結(jié)果提示:(1)訓練應激能使下丘腦室旁核細胞內(nèi)的即刻基因信息系統(tǒng)快速激活,使下丘腦神經(jīng)細胞處于活化狀;(2)不同形式訓練刺激下,大鼠下丘腦PVN中c-fosmRNA表達存在明顯差異,其機制可能是訓練性質(zhì)和強度不同所致。間歇訓練法是一種極限強度并且嚴格控制運動和間歇時間的無氧訓練方法,由于間歇期的存在,幾乎在整個運動期均為最高強度的運動,并且能重復多次,因而在強度和量方面均保持高水平,在供能及生理反應特點上均嚴格區(qū)分于持續(xù)訓練,持續(xù)訓練是一種有氧訓練方法,其特點是強度小,但運動時間較長。間歇訓練相對于持續(xù)訓練來說,承擔的負荷更大,產(chǎn)生的應激反應更強。

[1]盧曉虹,李凌江,李昌琦,等.應激對中樞神經(jīng)系統(tǒng)即刻早期基因c-fos表達及HPA軸的調(diào)節(jié)作用研究[J].中國心理衛(wèi)生雜志,2000,14(1):102.

[2]Makoto,Funahashi,Yifen He,et al.Noxious tooth pulp stimulation suppresses c-fosexpression in the rat hippocampal formation[J].Brain Research,1999(7):215.

[3]Katano H,Fujita K,Kato T,et al.A metabotropic glutamate receptor antagonist,alpha-methyl-4-car-boxyphenylglycine,attenuates immediate early genemRNA expression following traumatic injury in cultured rat cortical glial cells[J].Neurosci Lett,2001,306(1-2):101.

[4]Cullinan WE,Herman JP,Battaglia DF,etal.Pattern and time course of immediate earlygene expression in rat brain following acutestress[J].Neurosci,1995,64(2):477.

[5]Baffi JS,Palkovits M.Fine topography of brain area sactivated by cold stress.A fos immunohisto chemical study in rats[J].Neuroendocrinology,2000,72(2):102.

[6]宋春杰,齊建國,章為.束縛應激大鼠下丘腦內(nèi)一氧化氮合酶與c-fos蛋白的共存.神經(jīng)解剖學雜志,1997,13(2):161.

[7]Habib KE,Gold PW,Chrousos GP.Neuroendocrinology of stress[J].Endocrinol Metab Clin North Am,2001,30(3):695-728.

Experimental Study on the Influence of Different Swimm ing Exercises on the Expression of c-fosm RNA in the Pavaventricular Nuclei of Rat

Yu Fang1,Zhang Anmin2,Hu Shuping3
(1.Collegeof Phydical Education,North university of China,Taiyuan,030051,Shanxi,China;2.College of Phydical Education,YanTai university Yantai,264005,Shandong,China;3.The Hospital of School,Finance and Economics university of Shanxi Taiyuan,030006,Shanxi,China)

To study the effect of endurance exercise and intermittent exercise on the expression of c - fosmRNA in pavaventricular nuclei (PVN) . Endurance swimming exercise and intermittent exercise could affect the expression of c - fos mRNA in PVN ,and the expression of c - fosmRNA was timelines ,and the mechanism due to the distribution of CRF and CRFR1in PVN.

endurance exercise;intermittent exercise;pavaventricular nuclei(PVN);c-fosmRNA;rat

G804.5

A

1672-1365(2010)02-0082-03

2009-12-09;

2010-02-07

國家自然科學基金項目(30671019)。

于芳(1968-),女,山西人,副教授,碩士生導師,研究方向:訓練醫(yī)學。