張影陸，劉春鳳，董建軍，李鵬飛，李 崎，*，顧國(guó)賢

（1.江南大學(xué)教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2.青島啤酒股份有限公司科研中心，山東青島266101）

無(wú)機(jī)離子影響啤酒口感機(jī)理的初步研究

張影陸1，劉春鳳1，董建軍2，李鵬飛1，李 崎1，*，顧國(guó)賢1

（1.江南大學(xué)教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2.青島啤酒股份有限公司科研中心，山東青島266101）

【目的】考察無(wú)機(jī)陽(yáng)離子Ca2+、Mg2+、K+、Na+和無(wú)機(jī)陰離子Cl-、對(duì)啤酒口感的影響，并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行初步探討?！痉椒ā坎捎煤舜殴舱瘢∟MR）檢測(cè)方法，對(duì)不同離子濃度啤酒樣品中質(zhì)子化學(xué)位移進(jìn)行分析。通過(guò)感官品評(píng)對(duì)啤酒樣品整體口感協(xié)調(diào)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，然后將品評(píng)結(jié)果與核磁共振檢測(cè)結(jié)果比對(duì)來(lái)說(shuō)明利用質(zhì)子化學(xué)位移考察啤酒口感差異的可能性?！窘Y(jié)果】無(wú)機(jī)離子對(duì)啤酒體系中的氫鍵結(jié)構(gòu)的形成起到促進(jìn)或破壞的作用?？诟休^好的樣品，其核磁共振圖譜中羥基質(zhì)子化學(xué)位移相應(yīng)較大，反之亦然?！窘Y(jié)論】口感品評(píng)結(jié)果與質(zhì)子化學(xué)位移間具有很好的符合度，從氫鍵締合的角度來(lái)解釋無(wú)機(jī)離子影響啤酒口感的作用機(jī)制具有很大的可行性。

啤酒，氫鍵，無(wú)機(jī)離子，核磁共振（NMR），口感

啤酒是一種釀造產(chǎn)品，其組成成分非常復(fù)雜。目前能檢出的物質(zhì)已達(dá)1000余種。啤酒中的無(wú)機(jī)成分一般指陽(yáng)、陰離子。陽(yáng)離子包括Ca2+、Mg2+、K+、 Na+、Zn2+、Fe2+等，陰離子主要有 Cl-、等。啤酒中的無(wú)機(jī)成分，主要來(lái)源于釀造所用的原料、添加劑、各種助劑及工藝生產(chǎn)過(guò)程涉及的設(shè)備、容器等，它們對(duì)啤酒風(fēng)味、口感等起著至關(guān)重要的作用［1］。啤酒口感柔和性的評(píng)價(jià)是感官感受的抽象描述，為便于研究，將概念具體化，認(rèn)為口感柔和是指啤酒醇味適當(dāng)，入口綿軟，酒體醇厚；不柔和指醇味沖口，入口暴烈，酒體淡薄，有水味。根據(jù)國(guó)內(nèi)外對(duì)白酒、米酒、蒸餾酒、日本清酒［2］、威士忌等釀造飲料酒的研究發(fā)現(xiàn)，醇、水的結(jié)構(gòu)變化對(duì)酒類口感有較大影響，他們認(rèn)為酒入口刺激感降低，變得較為柔和綿軟，與醇水結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)，而醇水締合結(jié)構(gòu)通過(guò)氫鍵連接。氫鍵的強(qiáng)弱與多少直接影響醇水聚合物的結(jié)構(gòu)［3-7］。結(jié)合柔和性描述可以發(fā)現(xiàn)，口感的柔和與否與酒中醇水有一定關(guān)系［8］，而醇水結(jié)構(gòu)又與氫鍵締合有關(guān)，因此在研究啤酒的口感柔和性時(shí)，重點(diǎn)研究啤酒中的氫鍵締合情況，核磁共振通過(guò)其參數(shù)“化學(xué)位移”可以準(zhǔn)確地測(cè)定出啤酒中氫鍵的變化情況，從而可以知道醇水締合的強(qiáng)弱。稀釋用水會(huì)影響啤酒體系中的氫鍵，稀釋用水的性質(zhì)是由水中無(wú)機(jī)離子決定的，因此，稀釋用水對(duì)啤酒風(fēng)味的影響主要是指無(wú)機(jī)離子的影響，本工作從這一角度出發(fā)，結(jié)合各口感品評(píng)，初步探討了核磁共振參數(shù)“化學(xué)位移”與高稀釋率啤酒風(fēng)味柔和性與協(xié)調(diào)性的關(guān)系。從氫鍵的角度研究啤酒的特性將對(duì)啤酒釀造業(yè)的發(fā)展有一定的推動(dòng)作用。

表1 高稀釋率啤酒的制備

表2 原子吸收分光的工作條件

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

13°P原酒 青島（上海松江）啤酒有限公司提供；8°P啤酒樣品 市購(gòu)；原水青島（上海松江）啤酒有限公司提供，經(jīng)砂濾的江水，電導(dǎo)率為0.847ms/cm；反滲透膜過(guò)濾水 經(jīng)沙濾—碳濾—碳濾—反滲透膜過(guò)濾—脫氧處理后的江水，平均電導(dǎo)率為0.023ms/cm；乙醇 北京化工廠，色譜純；氧化氘（D2O）、二甲基硅代戊磺酸鈉（DSS）、四甲基硅烷（TMS） 北京化工廠，光譜級(jí)；硝酸銀、硫酸鉀、氯化鋇、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鈉、濃硝酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析級(jí)。

pHS-3C型精密 pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；Avance AV-500型核磁共振波譜儀 瑞士Bruker公司；原子吸收分光光度計(jì)SpectraAA220 美國(guó)Varian（瓦里安）公司；K、Na、Mg、Ca空心陰極燈 威格拉斯（北京）有限公司；馬弗爐SX-4-10 上海洪紀(jì)設(shè)備儀器公司；L-204型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 低度成品稀釋酒樣的制備方法

為了得到不同離子含量的成品啤酒，實(shí)驗(yàn)選擇在反滲透膜過(guò)濾水中添加不同比例原水的方法以獲取不同離子含量的稀釋水，以表1中所選擇的13種不同稀釋水稀釋13°P高濃酒體制成8°P成品啤酒，然后進(jìn)行在線滅菌處理。

實(shí)驗(yàn)每批制備300mL啤酒樣品，根據(jù)所選稀釋率及稀釋水配比得出每批每種低度啤酒制備所需的RO水、原水及原酒的量。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 核磁共振測(cè)定方法

1.3.1.1 測(cè)定原理［9-11］具有磁矩的原子核（如1H，13C，19F，31P等）在外磁場(chǎng)中將發(fā)生能級(jí)分裂，核磁具以不同取向繞外磁場(chǎng)回旋。當(dāng)另一個(gè)垂直外場(chǎng)的射頻磁場(chǎng)同時(shí)作用于核上，并且其照射場(chǎng)的頻率等于核在外磁場(chǎng)中的回旋頻率時(shí)即發(fā)生核磁共振，處于低能級(jí)的核躍遷到高能級(jí)，產(chǎn)生相應(yīng)的信號(hào)，即由磁性核受輻射而發(fā)生躍遷所形成的吸收光譜。高分辨率質(zhì)子核磁共振（1H-NMR）非常適合研究氫鍵締合。1H-NMR可反映不同化學(xué)環(huán)境、不同屏蔽作用下質(zhì)子的化學(xué)位移，特別是對(duì)醇溶液，因?yàn)闅滏I的形成降低了羥基（OH）中質(zhì)子周圍電子云密度，降低核在磁場(chǎng)的屏蔽效應(yīng)，觀察到共振現(xiàn)象向高頻移動(dòng)。OH質(zhì)子對(duì)于烷基鏈上質(zhì)子共振位移可以作為形成氫鍵的參數(shù)。通過(guò)質(zhì)子化學(xué)位移的變化可以推測(cè)分子結(jié)構(gòu)、分子間相互作用。

1.3.1.2 樣品處理 啤酒除氣：取預(yù)先在冰箱中冷卻至15～20℃的啤酒，啟蓋后經(jīng)快速濾紙過(guò)濾至三角瓶中，稍加振搖，靜置，以充分除去酒中的CO2。

1.3.1.3 測(cè)定條件 氫核共振頻率500.130MHz，配置5mm QNP（四核探頭13C-1H-31P-19F）探頭。D2O鎖場(chǎng)，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為四甲基硅烷（TMS），檢測(cè)溫度為18℃。

D2O置于12cm一端封口熔點(diǎn)毛細(xì)管內(nèi)鎖場(chǎng)，再放在核磁檢測(cè)管中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 啤酒中離子測(cè)定方法

1.3.2.1 無(wú)機(jī)陽(yáng)離子 樣品處理方法［12］：準(zhǔn)確吸取除氣后的啤酒樣品2mL于50mL經(jīng)（1+1）HNO3溶液浸泡48h的瓷坩堝中，將坩堝放在控溫電爐上進(jìn)行低溫炭化直至冒煙至盡。若發(fā)現(xiàn)炭化不完全，可沿坩堝壁滴加幾滴濃硝酸，幫助炭化。將炭化好的樣品放入馬弗爐中，550℃保持5h，使樣品完全灰化。冷卻后，先用1mL（1∶1）HNO3溶解，移入50mL容量瓶中并定容。同時(shí)做好樣品空白，即可進(jìn)行原子吸收法測(cè)定。具體測(cè)定條件如表2所示。

配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：為準(zhǔn)確定量，測(cè)定鈉和鉀時(shí)需加入鑭溶液作為釋放劑，測(cè)定鈣和鎂時(shí)加入鍶作為釋放劑。具體配制方法如下：

用移液管分別吸取含有Na和K離子的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度均為50μg/mL）0.00，0.25，0.50，1.00，2.00mL于25mL容量瓶中，用1%的HNO3和1.00g/L的氯化鍶作為溶劑定容，并作為測(cè)量時(shí)的空白液。此標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中含4種離子的溶度分別為0.00、0.50、1.00、2.00、4.00μg/mL。鈣鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法同上，只需換用1%的HNO3和1.50g/L氧化鑭作為溶劑定容，并作為測(cè)量時(shí)的空白液。

1.3.2.2 無(wú)機(jī)陰離子［13］無(wú)機(jī)陰離子主要包括氯離子和硫酸根離子，本實(shí)驗(yàn)選用AgCl比濁法和BaSO4比濁法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 口感品評(píng) 邀請(qǐng)8位專業(yè)品酒師（2名國(guó)家級(jí)評(píng)委和6位省級(jí)評(píng)委）對(duì)樣品進(jìn)行品評(píng)，并對(duì)樣品進(jìn)行綜合打分。具體口感品評(píng)規(guī)則見表3。

表3 啤酒口感協(xié)調(diào)性評(píng)價(jià)表

2 結(jié)果與討論

2.1 醇水模擬體系的核磁共振圖譜分析

表4 不同醇水溶液中OH質(zhì)子1H-NMR化學(xué)位移

為了準(zhǔn)確、合理地對(duì)啤酒中醇水締合的氫鍵作用進(jìn)行闡明，更清楚地表示出不同樣品間1H-NMR譜圖的差異，實(shí)驗(yàn)首先對(duì)一系列醇水體系中醇水締合現(xiàn)象進(jìn)行了研究。選取不同乙醇濃度的醇水溶液，按上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行1H-NMR分析，具體結(jié)果見表4。

由表4可知，在此實(shí)驗(yàn)條件下，純水的羥基質(zhì)子化學(xué)位移為4.8956ppm。隨著乙醇的加入，體系中由于醇與水的締合，開始逐步形成醇水氫鍵，隨著醇含量的增加，水中羥基質(zhì)子化學(xué)位移變化，并呈逐漸增大趨勢(shì)，當(dāng)乙醇比例為40%時(shí)，化學(xué)位移達(dá)到所選濃度中的最大值5.0957ppm，分析其原因可能是由于醇水氫鍵的形成，質(zhì)子周圍的電子云密度被氧原子吸引，造成質(zhì)子的電子云密度減小，質(zhì)子發(fā)生共振所需要的電磁場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)降低，從而只需在化學(xué)位移較大的低場(chǎng)就發(fā)生了共振現(xiàn)象。同時(shí)也說(shuō)明乙醇濃度為40%，醇水締合現(xiàn)象最為嚴(yán)重，即此時(shí)溶液中氫鍵數(shù)量最多。

對(duì)于成品啤酒來(lái)講，其酒精度一般都低于5%。因此，化學(xué)位移一般大多集中在4.8956～4.9354ppm之間。

2.2 不同離子含量樣品的核磁共振圖譜分析

對(duì)于高稀釋率低度成品啤酒來(lái)講，其乙醇含量較低，因此實(shí)驗(yàn)首先在同一成品8°P啤酒中分別添加0.2mmol/L CaCl2、MgCl2、K2SO4和Na2SO4，然后分別進(jìn)行核磁共振分析，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，具體結(jié)果見表5所示。

表5 不同離子含量的同一啤酒1H-NMR譜圖（ppm）

由表5可知，與原酒液中質(zhì)子化學(xué)位移相比，加入不同無(wú)機(jī)鹽后酒樣中質(zhì)子化學(xué)位移有明顯的變化，說(shuō)明無(wú)機(jī)離子對(duì)啤酒體系中的氫鍵結(jié)構(gòu)的形成起到了促進(jìn)或破壞的作用。對(duì)于添加CaCl2和MgCl2的樣品，其體系中除了Ca2+和Mg2+不同外，其他各種物質(zhì)含量均相同，此時(shí)添加CaCl2的樣品體系中化學(xué)位移比原酒樣降低，而添加MgCl2的樣品則增加，因此可以說(shuō)明Ca2+在此啤酒體系中破壞了部分氫鍵結(jié)構(gòu)，Mg2+促進(jìn)了體系中氫鍵結(jié)構(gòu)的形成。同理，K+對(duì)體系中氫鍵的形成起到了促進(jìn)作用，Na+對(duì)氫鍵的形成起到了破壞作用。另外，此方法測(cè)定重復(fù)性較好，樣品平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過(guò)0.0005。

表6 不同樣品口感品評(píng)結(jié)果及OH質(zhì)子1H-NMR化學(xué)位移（ppm）

2.3 核磁共振化學(xué)位移與啤酒口感的關(guān)系

根據(jù)口感品評(píng)的結(jié)果，選擇表1中的1#～10#樣品按上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行1H-NMR分析，具體結(jié)果見表6所示。

由表6可明顯看出，隨著原水添加比例的增加，水中羥基質(zhì)子化學(xué)位移先增加后又逐步降低，這說(shuō)明樣品體系中的氫鍵結(jié)構(gòu)不斷變化。對(duì)于同一高濃原酒稀釋成的酒樣，其所有樣品體系中的有機(jī)成分是一樣的，唯一不同的是所選有的稀釋水中原水的添加比例不相同，即稀釋水中的離子不相同。這也就是說(shuō)稀釋酒樣中只有無(wú)機(jī)離子含量不相同。因此，分析羥基質(zhì)子化學(xué)位移降低的原因可能是離子影響了醇水氫鍵的形成，隨著離子含量的增加，離子先是促進(jìn)樣品體系中氫鍵結(jié)構(gòu)的形成，當(dāng)離子增加到一定程度時(shí)，又開始逐漸破壞氫鍵結(jié)構(gòu)。其中在樣品質(zhì)子化學(xué)位移降低時(shí)，8#樣品的化學(xué)位移略有升高，分析其原因可能是樣品中隨著原水比例的增加，無(wú)機(jī)離子的濃度越來(lái)越高，出現(xiàn)有離子之間的協(xié)同效應(yīng)，因此化學(xué)位移變大，但是后來(lái)樣品的總體趨勢(shì)在降低。結(jié)合口感品評(píng)的結(jié)果可知，口感品評(píng)中口感較好、得分較高的樣品，其核磁共振圖譜中羥基質(zhì)子化學(xué)位移就相應(yīng)越大，說(shuō)明兩者具有較好的符合度，即口感品評(píng)中柔和性與協(xié)調(diào)性較好的樣品，其羥基質(zhì)子化學(xué)位移相對(duì)較大，反之亦然。

2.4 高稀釋率低度成品啤酒中較佳離子范圍的初步確定

為了初步確定高稀釋率成品啤酒中較佳的離子含量范圍，實(shí)驗(yàn)選擇表6中樣品10，分別添加CaCl2、MgCl2、K2SO4和Na2SO4四種無(wú)機(jī)鹽，添加量選擇四個(gè)梯度，分別為0.25、0.50、0.75和1.00mmol/L。然后分別進(jìn)行核磁共振分析，結(jié)果見圖1和圖2。

由圖1和圖2可知，當(dāng)沒(méi)有向啤酒中添加任何無(wú)機(jī)離子時(shí)，原酒中水中質(zhì)子化學(xué)位移為4.9113ppm，添加無(wú)機(jī)離子后，酒體中水質(zhì)子中化學(xué)位移有著不同的變化。對(duì)于添加 CaCl2的樣品，當(dāng)添加量為0.25mmol/L和0.50mmol/L時(shí)其體系中的羥基質(zhì)子化學(xué)位移是大于原酒中的化學(xué)位移，說(shuō)明此時(shí)體系中促進(jìn)了氫鍵結(jié)構(gòu)的形成，酒體風(fēng)味柔和性與協(xié)調(diào)性較原酒有所提高。而當(dāng)添加量為0.75mmol/L和1.00mmol/L時(shí)，體系中化學(xué)位移均有較大降低，小于原酒體所對(duì)應(yīng)的化學(xué)位移，即此時(shí)原酒體中氫鍵結(jié)構(gòu)被破壞，酒體柔和性與協(xié)調(diào)性降低。同理可知，對(duì)于MgCl2添加量分別為0.25mmol/L和0.50mmol/L時(shí)，有利于啤酒體系中氫鍵的形成，而當(dāng)添加量為0.75mmol/L和1.00mmol/L時(shí)，氫鍵結(jié)構(gòu)亦遭到破壞，其中當(dāng)添加量為1.00mmol/L時(shí)，對(duì)應(yīng)的化學(xué)位移有所增加，原因可能是由于離子之間的協(xié)同作用，促進(jìn)了體系中氫鍵的形成。對(duì)于K2SO4和Na2SO4，只有當(dāng)添加量在0.25mmol/L時(shí)，所對(duì)應(yīng)的化學(xué)位移大于原酒體，而其它三種添加量對(duì)應(yīng)的化學(xué)位移均小于原酒體。

綜上分析可知，CaCl2和MgCl2的添加量分別低于 0.50mmol/L時(shí)有利于啤酒口感，而 K2SO4和Na2SO4添加量低于0.25mmol/L時(shí)有利于啤酒口感，此時(shí)啤酒中Ca2+、Mg2+、K+、Na+、Cl-、SO2-4的最大添加量分別為20、10、9.75、5.75、35.50、24.00mg/L。

圖1 原始啤酒樣品的1H-NMR譜圖

圖2 不同離子含量的同一啤酒中OH質(zhì)子化學(xué)位移

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)對(duì)不同醇水濃度的核磁共振圖譜分析可知，純水的羥基質(zhì)子化學(xué)位移為4.8956ppm。隨著乙醇的加入，體系中由于醇與水的締合，開始逐步形成醇水氫鍵，隨著醇含量的增加，水中羥基質(zhì)子化學(xué)位移變化，并呈逐漸增大趨勢(shì)，當(dāng)乙醇比例為40%時(shí)，化學(xué)位移達(dá)到所選濃度中的最大值5.0957ppm，說(shuō)明乙醇濃度為40%，醇水締合現(xiàn)象最為嚴(yán)重，即此時(shí)溶液中氫鍵數(shù)量最多。

3.2 與原酒液中質(zhì)子化學(xué)位移相比，加入不同無(wú)機(jī)鹽后酒樣中質(zhì)子化學(xué)位移有明顯的變化，說(shuō)明無(wú)機(jī)離子對(duì)啤酒體系中的氫鍵結(jié)構(gòu)的形成起到了促進(jìn)或破壞的作用。

3.3 口感品評(píng)中口感較好、得分較高的樣品，其核磁共振圖譜中羥基質(zhì)子化學(xué)位移相應(yīng)就越大，說(shuō)明兩者具有較好的符合度，即口感品評(píng)中柔和性與協(xié)調(diào)性較好的樣品，其羥基質(zhì)子化學(xué)位移相對(duì)較大，反之亦然。

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Preliminary study on mechanism of inorganic ions affecting on beer taste

ZHANG Ying-lu1，LIU Chun-feng1，DONG Jian-jun2，LI Peng-fei1，LI Qi1，*，GU Guo-xian1
（1.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Wuxi 214122，China；2.Science and Research Center，Tsingtao Brewery Co.，Ltd.，Qingdao 266101，China）

【Objective】The study aimed to observe the effect of inorganic positive ions（Ca2+，Mg2+，K+，Na+）and negative ions（Cl-，SO24-）on beer taste，and make a preliminary study on its mechanism【.Method】Chemical shifts of different ion concentration liquor were analyzed through nuclear magnetic resonance（NMR）method.Moreover，the whole harmony characteristic of beer samples was evaluated by sensory evaluation，and after that，the comparison of sensory evaluation results and NMR results was carried out to show the feasibility of studying beer taste difference by proton chemical shifts【.Results】lnorganic ions can destroy or strengthen the hydrogen bonding.Moreover，the change of chemical shift was higher for the beer sample with better taste，vice versa.【Conclusion】The proton chemical shift was consistent with sensory evaluation very well.lt’s very feasible to explain the mechanism of inorganic ions affecting on beer taste through the angle of hydrogen bonding of the beer body.

beer；hydrogen bonding；inorganic ions；nuclear magnetic resonance（NMR）；taste

TS262.5

A

1002-0306（2010）12-0100-04

2010-02-23 *通訊聯(lián)系人

張影陸（1968-），女，講師，研究方向：釀酒科學(xué)。

國(guó)家“十一五”支撐重點(diǎn)項(xiàng)目資助課題（2008BAI63B06）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2006AA020204）；國(guó)家“十一五”重大科技支撐專項(xiàng)（2007BAK36B01）。