謝 謹(jǐn)，龔豪杰，張 纓

耐力訓(xùn)練對(duì)AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌CPT-1表達(dá)的影響

謝 謹(jǐn)1，龔豪杰1，張 纓2

目的：研究耐力訓(xùn)練對(duì)AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌CPT-1mRNA和蛋白表達(dá)的影響，探討耐力訓(xùn)練中AMPKα2調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的可能途徑。研究方法：兩月齡C57BL/6J野生（WT）和AMPKα2基因敲除（KO）小鼠各20只，各自隨機(jī)分為安靜對(duì)照組，耐力訓(xùn)練組，每組10只。兩訓(xùn)練組進(jìn)行4周，每天1 h，速度為12 m/min的跑臺(tái)訓(xùn)練，測定股四頭肌CPT-1 mRNA和蛋白表達(dá)以及血清FFA、TG水平。結(jié)果：4周耐力訓(xùn)練之后，WT鼠和KO鼠骨骼肌CPT-1 mRNA和蛋白表達(dá)，與安靜對(duì)照組相比均顯著升高，且兩訓(xùn)練組之間無顯著差異。結(jié)論：耐力訓(xùn)練中AMPKα2不是CPT-1的唯一上游調(diào)節(jié)因子，可能有其他途徑參與CPT-1表達(dá)的調(diào)節(jié)。

耐力訓(xùn)練；AMPKα2；CPT-1；脂肪酸氧化

5'-腺苷酸活化的蛋白激酶（5'-AMP-activated protein kinase，AMPK）是真核生物中能量變化的感受器，AMPK在運(yùn)動(dòng)中被激活伴隨骨骼肌脂肪酸氧化作用的增強(qiáng)[1-2]。肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（carnitine palmitoyl transferase 1，CPT-1）是長鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行脂肪酸β氧化的限速酶，在脂肪酸代謝過程中起關(guān)鍵的調(diào)控作用。多項(xiàng)研究[3-5]表明，耐力運(yùn)動(dòng)能增加CPT-1在骨骼肌中的表達(dá)。這種運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后骨骼肌CPT-1表達(dá)增加是否與AMPK有關(guān)呢？因此，本研究以AMPKα2基因敲除和野生小鼠為研究對(duì)象，通過耐力訓(xùn)練觀察野生和基因敲除小鼠骨骼肌CPT-1mRNA和蛋白表達(dá)以及對(duì)血甘油三酯（TG）、血游離脂肪酸（FFA）的影響，探討耐力訓(xùn)練中AMPKα2調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的可能途徑。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

健康兩月齡C57BL/6J野生（WT）小鼠和AMPKα2基因敲除（Knockout，KO）小鼠各20只（由Department of Endocrinology，Metabolism and Cancer， Institute Cochin， UniversitéParis Descartes，F(xiàn)rance提供兩只AMPKα2基因敲除鼠，并由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所幫助保種繁殖），體重（18±2）g，根據(jù)體重隨機(jī)分為4組，每組10只：野生安靜對(duì)照組（C），野生耐力訓(xùn)練組（S），基因敲除安靜對(duì)照組（CK），基因敲除耐力訓(xùn)練組（SK）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)與運(yùn)動(dòng)方式

所有小鼠均在北京體育大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)房中飼養(yǎng)，每籠4～5只，室內(nèi)溫度（20～25）℃，相對(duì)濕度50%～70%，每天光照12 h，自由進(jìn)食，飲水，國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物常規(guī)飼料喂養(yǎng)。兩安靜對(duì)照組小鼠不施加運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，正?；\中飼養(yǎng)。兩耐力訓(xùn)練組小鼠采取每天1 h，每周6天，持續(xù)4周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，其中第1天跑臺(tái)速度為8 m/min，第2天10 m/min，第3天達(dá)到預(yù)定強(qiáng)度12 m/min，并維持此強(qiáng)度至4周訓(xùn)練結(jié)束。

1.3 取 材

最后一次訓(xùn)練結(jié)束即刻開始禁食，12 h后取材。乙醚麻醉，摘除雙側(cè)眼球取眼血，后立即取雙側(cè)股四頭肌，迅速投入液氮，再轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。血樣靜置30 min，4℃離心機(jī)3 000 r/min 20 min分離血清后，存于-20℃待用。

1.4 測定方法

1.4.1 RNA與蛋白樣品的制備 （1）總mRNA的提取。取骨骼肌50～100 mg在液氮環(huán)境下研磨成粉末后移入離心管中，加1 mLTrizol勻漿，顛倒混勻15 s，冰上靜置5 min后加0.2 mL氯仿，震蕩，冰上靜置5 min后12 000 r/min，4℃離心15 min，取上清液（約400 μL）移入另一離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后室溫下靜置10 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，棄上清，加入75%乙醇（用DEPC水配制）1 mL，7 500 r/ min，4℃離心10 min，棄上清，再次用75%乙醇洗滌，棄上清，在超凈臺(tái)中晾干，溶于10 μLDEPC水。最后用瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。

（2）蛋白提取。取骨骼肌100 mg在液氮環(huán)境下研磨成粉末后移入離心管中，加入蛋白裂解液（Tris-Cl、NaCl、EDTA、Tritonx-100、PMSF）1 mL勻漿，12 000 r/min，4℃離心1 h取上清。

1.4.2 指標(biāo)測定方法 （1）骨骼肌AMPKα2mRNA及CPT-1mRNA表達(dá)。采用實(shí)時(shí)熒光定量（Real-time PCR）兩步法。先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（RT）部分，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的PCR擴(kuò)增儀，型號(hào)MG96+/Y，RT-PCR試劑盒由Promega公司生產(chǎn)。具體反應(yīng)條件：70℃ 5 min；42℃ 1 h；70℃ 15 min。合成的cDNA于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩? 300熒光定量PCR儀和熒光染料反應(yīng)體系（SYBRR Green PCR Master Mix）購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems）。引物用引物設(shè)計(jì)軟件（Primer 5）設(shè)計(jì)，并經(jīng)BLAST驗(yàn)證后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。實(shí)時(shí)熒光量數(shù)值由實(shí)時(shí)定量PCR儀（StepOne實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，Applied Biosystems）讀取，目標(biāo)基因表達(dá)結(jié)果以比較CT法相對(duì)定量。目標(biāo)基因=2-△△CT。

表1 引物序列Table 1 Gene Primer sequences for PCR

（2）骨骼肌AMPKα2及CPT-1蛋白表達(dá)。用western blot法測定，先用考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白量，計(jì)算出蛋白上樣量后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出目的蛋白（AMPKα2，CPT-1）和內(nèi)參蛋白（β-actin），再轉(zhuǎn)移置硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶封閉30 min，1抗（1：1 000）4℃孵育過夜，1×TBST洗滌3次，1×TBS洗滌一次。室溫下二抗（1：2 000）孵育1 h，1×TBST洗滌3次，1× TBS洗滌1次。AMPKα2的一抗為AMPKα2，goat polyclonal IgG，Santa Cruz Biotechnology，Inc。CPT-1的一抗為CPT-1，goat polyclonal IgG，Santa Cruz Biotechnology，Inc。內(nèi)參的一抗為 β-actin，mouse monoclonal IgG1，Santa Cruz Biotechnology，Inc。所有二抗均為 donkey anti-goat IgG-HRP，Santa Cruz Biotechnology，Inc。曝光前加入發(fā)光液反應(yīng)1 min，入暗室用X光片壓片曝光。用生物電泳圖像分析軟件（FR-980 Smart View，復(fù)日科技）拍照，最后用ImageJ軟件讀取條帶積分灰度值，結(jié)果用相對(duì)積分灰度值（目的/內(nèi)參）表示。

（3）血清甘油三酯（Triglyceride，TG）和血清游離脂肪酸（Free fatty acids，F(xiàn)FA）水平的測定，試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理，計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差），統(tǒng)計(jì)方法采用雙因素方差分析，組間差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05達(dá)到顯著性水平。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1AMPKα2mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)

由表2可見，經(jīng)過4周耐力訓(xùn)練，野生鼠骨骼肌AMPKα2 mRNA和蛋白表達(dá)水平，與安靜對(duì)照組相比均顯著升高（P<0.05）。

Table表 2 2 Th耐e力 ef訓(xùn)fec練t 對(duì)of eAnMdPurKaαnc2em trRaNinAin、y蛋 o白n 表AM達(dá)P水Kα平2的m影RN響A and protein expression （n=8）

2.2 CPT-1mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)

由圖1和圖2可見，4周耐力訓(xùn)練之后，野生鼠和KO鼠骨骼肌CPT-1 mRNA和蛋白表達(dá)，與安靜對(duì)照組相比均顯著升高，且兩訓(xùn)練組之間無顯著差異。

圖1 耐力訓(xùn)練CPT-1mRNA表達(dá)的影響Figure 1 The effect of endurence training on CPT-1 mRNA expression

圖2 耐力訓(xùn)練CPT-1蛋白表達(dá)的影響Figure 2 The effect of endurence training on CPT-1 Protein expression

2.3 血清TG和FFA變化

由表3可見，4周耐力訓(xùn)練之后，與安靜對(duì)照組相比，野生鼠血清TG值無明顯變化，而KO鼠血清TG值顯著下降（P<0.05）。各組血清FFA之間均無顯著性差異。

Table3 Blo表od3s se各ru組m小FF鼠Aa血n清dTTGGle和velFsFinAth水ef平ou比rtr較eatmen（tmgmrooul/pLs）

3 分析討論

3.1耐力訓(xùn)練對(duì)AMPKα2mRNA和蛋白表達(dá)的影響

Wojtaszewski J F等[6]讓6名健康男子以45%最大攝氧量強(qiáng)度進(jìn)行功率自行車試驗(yàn)直到力竭，測得運(yùn)動(dòng)中AMPKα2活性連續(xù)性升高，在力竭時(shí)達(dá)最大值。Durante P E等[7]對(duì)大鼠的研究也發(fā)現(xiàn)，7周遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練以后，股四頭肌AMPKα2的活性顯著升高。Fr準(zhǔn)sig C等[8]通過人體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3周耐力訓(xùn)練并未增加股外側(cè)肌中AMPKα2的蛋白表達(dá)，大鼠實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)遞增負(fù)荷耐力訓(xùn)練后AMPKα2活性顯著增強(qiáng)，但蛋白表達(dá)變化甚微[7]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4周耐力訓(xùn)練以后，野生耐力訓(xùn)練組小鼠股四頭肌AMPKα2的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平都明顯高于野生安靜對(duì)照組（見表2），表明該耐力訓(xùn)練能夠明顯增加野生鼠骨骼肌AMPKα2mRNA和蛋白表達(dá)。

3.2 耐力訓(xùn)練對(duì)CPT-1mRNA和蛋白表達(dá)的影響

Tunstall R J等[3]研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)9天運(yùn)動(dòng)使CPT-1mRNA表達(dá)顯著增加57%（P<0.05）以及Russell A P等[4]的研究表明9周耐力訓(xùn)練使CPT-1mRNA表達(dá)增加75%（P<0.01）。國內(nèi)研究也表明8周有氧運(yùn)動(dòng)可以明顯增加小鼠骨骼肌CPT-1mRNA和蛋白表達(dá)[5]。從本研究結(jié)果來看，經(jīng)過4周跑臺(tái)訓(xùn)練后，訓(xùn)練組小鼠骨骼肌內(nèi)CPT-1mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于安靜對(duì)照組（見圖2，圖4），與以上研究結(jié)果相同。耐力訓(xùn)練能夠增加CPT-1mRNA和蛋白表達(dá)，原因可能與脂肪酸供能特點(diǎn)有關(guān)，長時(shí)間、中低強(qiáng)度的耐力運(yùn)動(dòng)中，脂肪酸是提供能量的主要來源，CPT-1作為長鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體內(nèi)膜的限速酶在脂肪酸供能過程中發(fā)揮重要作用。因此每天1 h，持續(xù)4周的反復(fù)訓(xùn)練可能在時(shí)間和次數(shù)上對(duì)刺激CPT-1轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上升產(chǎn)生積累效應(yīng)，造成CPT-1mRNA和蛋白表達(dá)增多。

3.3 耐力訓(xùn)練對(duì)AMPKα2基因敲除鼠CPT-1表達(dá)水平及血脂的影響

CPT-1作為長鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體內(nèi)膜的限速酶，控制著長鏈脂肪酸的β氧化過程[9]。丙二酰輔酶A（Malonyl-CoA，MCA）可通過抑制CPT-1活性而阻礙長鏈脂肪酸的β氧化[10-11]。體外研究發(fā)現(xiàn)5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside（AICAR）能夠激活骨骼肌中AMPK，最終減少M(fèi)CA合成，并伴隨骨骼肌脂肪酸氧化作用增強(qiáng)[12]，提示AMPK可能通過調(diào)節(jié)CPT-1而控制骨骼肌脂肪酸氧化過程。也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌內(nèi)CPT-1mRNA含量比正常野生鼠低26%[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通過4周耐力訓(xùn)練，S組CPT-1mRNA和蛋白表達(dá)較之C組分別增加1.0倍（P<0.05）和2.2倍（P<0.05），同樣，SK組CPT-1mRNA和蛋白表達(dá)比CK組增加了0.5倍（P<0.05）和1.3倍（P<0.05），表明耐力訓(xùn)練中AMPKα2的敲除并沒有影響CPT-1表達(dá)水平的上升。同時(shí)，并未發(fā)現(xiàn)CPT-1mRNA和蛋白表達(dá)在兩種鼠間出現(xiàn)顯著差異。近年來研究發(fā)現(xiàn)AMPKγ3也對(duì)骨骼肌脂肪酸代謝起重要調(diào)節(jié)作用[14-15]以及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1/2（extracellular regulated kinase1/2，ERK1/2）也參與調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)中骨骼肌脂肪酸攝取和氧化過程。綜上所述，運(yùn)動(dòng)對(duì)CPT-1表達(dá)的調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的過程，在耐力訓(xùn)練中AMPKα2可能不是CPT-1唯一調(diào)節(jié)因子，AMPKα2對(duì)CPT-1表達(dá)的影響可能被其他調(diào)節(jié)通路或機(jī)制所代償，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

另外，同種基因型鼠耐力訓(xùn)練前后及野生和基因敲除鼠間血清FFA無顯著性差異，推測FFA受多種因素的調(diào)節(jié)如激素leptin，因而血清中濃度相對(duì)恒定。但耐力訓(xùn)練后AMPKα2基因敲除鼠SK組比CK組血清TG水平顯著下降（P<0.05），原因仍有待于進(jìn)一步研究。

4結(jié) 語

4周耐力訓(xùn)練，AMPKα2基因敲除和野生型小鼠股四頭肌中CPT-1mRNA和蛋白表達(dá)均顯著性升高，且兩種鼠間無顯著差異，提示耐力訓(xùn)練中AMPKα2不是CPT-1的唯一上游調(diào)節(jié)因子，可能有其他途徑參與CPT-1表達(dá)的調(diào)節(jié)。

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Effect of Endurance Training on Skeletal Muscle CPT-1 Expression of α2-AMPK Whole-body Knockout Mice

XIE Jin1,GONG Haojie1,ZHANG Ying2
(1.Graduate School,Beijing Sport University,Beijing 100084,China;2.Institute of Human Sports Science,Beijing Sport University,Beijing 100084,China)

Objective:To study the effect of endurance training on skeletal muscle CPT-1 mRNA and protein expression of α2-AMPK whole-body knockout (KO)mice.Meanwhile,we also explore the possible role of AMPKα2 in regulating fatty acid oxidation in endurance training.Methods:C57BL/6J wild-type (WT)mice (n=20)and α2-AMPK whole-body knockout(KO)mice (n=20),two months old,were randomly subdivided into control groups and exercise groups.Quadriceps femoris muscle was removed after 4 weeks treadmill running (12m/min,1h/day).Expression of CPT-1 mRNA and protein,blood serum FFA and TG levels were measured.Results:After 4 weeks endurance training,skeletal muscle CPT-1 mRNA and protein expression of WT and KO mice were significantly higher than control groups.At the same time,there were no significant differences between two exercise groups.Conclusion:AMPKα2 is not the only upstream regulatory factor of CPT-1 in endurance training,and there could have other factors which regulate CPT-1 mRNA and protein expression during this kind of training.

endurance training;AMPKα2;CPT-1;fatty acid oxidation

G 804.7

A

1005-0000（2010）01-0030-03

2009-12-22；

2010-01-10；錄用日期：2010-01-12

北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：5072031）；衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題基金（項(xiàng)目編號(hào)：ZDS200804）

謝 謹(jǐn)（1986-），女，安徽巢湖人，北京體育大學(xué)在讀碩士研究生。

1.北京體育大學(xué)研究生院，北京100084；2.北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，北京100084。