徐艷梅，許傳文

（湖北省武漢市普愛醫(yī)院，腎內(nèi)科 湖北 武漢 430030）

糖尿病腎病 (diabetic nephropathy DN)是糖尿病最為嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量并威脅患者的生命，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。近期研究及臨床資料提示，細(xì)胞間黏附分子（intercellular adhesion molecular-1，ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子（vascular cell adhesion molecular-1，VCAM-1）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展，能增加尿蛋白、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積、引起腎小球纖維化[1，2]。有學(xué)者觀察，血管緊張素受體Ⅱ(AngⅡ)拮抗劑（英文全名，ARB）可以通過抑制黏附分子合成而減輕腎小球炎癥[3]。本文對(duì)鏈脲佐菌素（英文全名，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠給予替米沙坦治療，觀察了替米沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎小球ICAM-1、VCAM-1表達(dá)的影響，旨在從黏附分子角度探討替米沙坦對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器與試劑

全自動(dòng)生化分析儀（美國Beckman公司，CX5CE）；HIMAS-2000圖像分析系統(tǒng)（湖北千屏影像有限公司）；STZ（美國 Sigma公司,批號(hào)：BF1003）；替米沙坦（德國勃林格殷格翰制藥有限公司）；SP試劑盒（北京中山公司,）；山羊抗大鼠ICAM-1和山羊抗大鼠VCAM-1抗體（Santa Cruz公司）；Trizol試劑盒（美國GIBCO公司）；

1.2 動(dòng)物

健康 SD大鼠 18只，雄性，體重（180±20）g（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立與分組

健康雄性SD大鼠，于左腎切除后一周，開始禁食10 h。然后，單次腹腔注射50 mg/kg STZ，用0.1 mol/L無菌檸檬酸緩沖液配制，pH4.5）。72 h后取尾靜脈血測(cè)血糖，尿糖試紙測(cè)尿糖。血糖≥16.7 mmol/L，尿糖（3+～4+）者選入糖尿病大鼠模型[2]。正常對(duì)照組僅注射等量的檸檬酸緩沖液。糖尿病大鼠隨機(jī)分成DM組（糖尿病組）6只；R組（替米沙坦治療組）6只；C組（正常對(duì)照組）6只。R組以替米沙坦5 mg/kg·d靜脈給藥；C組和DM組每天同體積生理鹽水灌胃。所有大鼠在整個(gè)灌胃期間均喂標(biāo)準(zhǔn)飲食，不得使用胰島素。12周后處死動(dòng)物并收集3 mL下腔靜脈血及處死前24 h尿，留取右側(cè)腎臟并稱重。部分腎組織以10%甲醛固定，其余組織置于-80℃冰箱中凍存。

2.2 生化檢查

留24 h尿檢測(cè)尿蛋白定量。血標(biāo)本檢測(cè)血糖、血肌酐。并計(jì)算腎重與體重之比。

2.3 腎組織病理學(xué)檢查

腎小球PAS染色及病理程度分析：常規(guī)固定、包埋、3μm切片PAS染色。高倍鏡下順序觀察，每張切片觀察5個(gè)腎小球，每組觀察5張切片，用HIMAS-2000圖像分析系統(tǒng)定量測(cè)量每個(gè)腎小球的面積（GA），腎小球內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)面積（ECM）。結(jié)果用ECM/GA表示，即代表腎小球增生程度。

2.4 免疫組化檢測(cè)

采用SP法進(jìn)行染色分析。腎臟標(biāo)本固定，石蠟包埋切片，分別按試劑盒說明進(jìn)行ICAM-1和VCAM-1染色。再由兩位免疫病理人員對(duì)染色標(biāo)本進(jìn)行評(píng)定，同時(shí)觀察陽性細(xì)胞在腎小球內(nèi)的分布。然后，利用HIMAS-2000病理圖像分析系統(tǒng)，測(cè)定ICAM-1和VCAM-1陽性著色的平均灰度×面積比。由此對(duì)ICAM-1和VCAM-1進(jìn)行半定量分析。

2.5 腎組織總蛋白提取和Western-blot檢測(cè)

稱取100 mg腎組織，剪碎，1 mL蛋白裂解液[50 mM Tris（pH7.5），150mM NaCl，5 mM MgCl2，5 mM EDTA，0.5%NP40，1 mM PMSF，20μg/mL Aprotintin]中勻漿，考馬司亮藍(lán)G250測(cè)蛋白濃度。取腎組織蛋白100μg經(jīng)10%的SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液4℃封閉，再加入山羊抗大鼠ICAM-1和山羊抗大鼠VCAM-1抗體4℃過夜后，用AP標(biāo)記的兔抗山羊IgG進(jìn)行雜交，洗膜后進(jìn)行NBT/BCIP顯色。雜交結(jié)果MGIAS-1000凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)量吸光度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 生化、腎重及病理改變

與C組相比，DM組及R組大鼠血糖、蛋白尿定量、血清肌酐均顯著性升高（P＜0.01）；與DM組相比，R組大鼠蛋白尿定量與血清肌酐顯著性降低（P＜0.01），血糖無明顯變化；與C組相比，DM組大鼠腎臟重量增大，R組腎重小于DM組并大于C組，但無顯著性意義。詳見表1。大鼠腎組織光鏡下可見DM組及R組腎小球部分體積增大，系膜區(qū)有不同程度增生，間質(zhì)可見中性粒及單核淋巴細(xì)胞浸潤，C組未見明顯異常。詳見圖1。

3.2 免疫組化

與C組相比，DM組及R組ICAM-1和VCAM-1表達(dá)增加（P＜0.01），但R組ICAM-1表達(dá)顯著低于DM組（P＜0.01）,R組VCAM-1表達(dá)顯著低于DM組（P＜0.01）。詳見表2、圖2。

表1 各組大鼠血，尿生化結(jié)果 （±s）

表1 各組大鼠血，尿生化結(jié)果 （±s）

注：1）與 C組相比，P ＜0.05；2）與 C組相比，P ＜0.01；3）與 DM組相比，P ＜0.05；4）與 DM組相比，P ＜0.01

組別 鼠數(shù) 血糖（mmol/L） 尿蛋白（mg/d） 血清肌酐（μmol/L） ECG/GA 腎重/體重(×10-3)C組 6 6.46±0.79 10.50±2.48 58.69±12.63 0.21±0.03 4.70±0.67 DM組 6 21.38±2.372） 49.03±11.372） 122.12±18.632） 0.53±0.042） 8.82±0.852）R 組 6 20.50±1.732） 32.21±3.72）3） 79.09±12.391）4） 0.33±0.031）4） 7.86±1.002）

圖1 腎臟病理圖片

表2 各組大鼠ICAM-1、VCAM-1免疫組化結(jié)果

3.3 ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)

DM組及R組ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)與免疫組化表達(dá)相一致，見表3、圖3。

表3 各組大鼠ICAM-1、VCAM-1的Western印跡結(jié)果

圖2 免疫組化圖片

圖3 免疫印跡圖片

4 討論

本實(shí)驗(yàn)使用雄性SD大鼠單腎切除一次性腹腔注射STZ進(jìn)行造模，結(jié)果造模12周后，尿蛋白的排泄率、腎重/體重比值、血清肌酐增加，光鏡下可見腎臟細(xì)胞外基質(zhì)積聚，基底膜增厚，表明模型成功，與文獻(xiàn)[4]基本一致，大鼠尚處于糖尿病腎病早期。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠腎臟肥大，尿蛋白的排泄增加，細(xì)胞外基質(zhì)增生積聚，基底膜增厚，腎組織ICAM-1和VCAM-1表達(dá)增加。替米沙坦可使實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠腎組織病變減輕，顯著減少尿蛋白，并可以抑制腎組織ICAM-1和VCAM-1表達(dá)。

糖尿病腎病時(shí)白細(xì)胞在腎小球和腎間質(zhì)的浸潤是糖尿病腎病組織的特征性表現(xiàn)之一，并在腎小球硬化方面起重要作用。SUGIMOTO[5]第一次提出，在糖尿病大鼠早期腎臟，ICAM-1表達(dá)明顯增加而且伴有大量白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤，并認(rèn)為腎臟高濾過可能是其主要原因。為了進(jìn)一步證實(shí)兩者之間的聯(lián)系，已有大量的試驗(yàn)證實(shí)，用抗ICAM-1的單克隆抗體阻斷ICAM-1/LFA-1作用可以防治T1DM。近年來OKADA[6]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因ICAM-1-/-的小鼠經(jīng)STZ誘導(dǎo)成模后，與ICAM-1+/+的小鼠相比，大大降低了血肌酐、尿素氮以及腎小球硬化指數(shù)等，進(jìn)而明顯延緩了糖尿病腎病的發(fā)展。MA[7]等甚至通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了ICAM-1參與糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的基因片段。另外，王小丹等[8]發(fā)現(xiàn)，在伴有腎臟病變的2型糖尿病患者血液內(nèi)，VCAM-1水平明顯要比沒有這些病變患者的高，可以假設(shè)VCAM-1參與了糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展。同時(shí)RUBIO-GUERRA等[9]也發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者血循環(huán)VCAM-1水平與患者蛋白尿成正比例關(guān)系。由此可見，ICAM-1和VCAM-1是糖尿病腎病發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ICAM-1和VCAM-1在正常對(duì)照組只有很少量的表達(dá)，而糖尿病組和糖尿病治療組表達(dá)明顯增強(qiáng)，表明其可能在高糖狀態(tài)下被激活，這與ALTANNAVCH等[10]研究結(jié)果相一致。ICAM-1和VCAM-1屬于免疫球蛋白超家族的成員，可介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與單核/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的黏附，從而有助于這些炎癥細(xì)胞游走到腎小球，導(dǎo)致一系列的細(xì)胞因子產(chǎn)生。單核/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤是糖尿病腎小球病變的特征之一，可能在糖尿病腎病腎小球肥大、細(xì)胞外基質(zhì)增多，毛細(xì)血管基底膜增厚、蛋白尿的發(fā)生和發(fā)展方面發(fā)揮重要作用[11]。本研究通過免疫組化和Western印跡分析方法發(fā)現(xiàn)，DM組大鼠ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)了ICAM-1和VCAM-1在糖尿病腎病發(fā)展中的作用。

有研究證實(shí)，腎素-血管緊張素系統(tǒng)參與了糖尿病腎病的進(jìn)展，其中AngⅡ起重要作用[12-13]。糖尿病時(shí)高血糖使腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性增高，尤其是腎組織中AngⅡ含量增加，導(dǎo)致血管通透性增加，炎癥細(xì)胞浸潤[14]。LIU[15]等證明，AngⅡ通過增強(qiáng)氧化酶活性介導(dǎo)ICAM-1表達(dá)、白細(xì)胞浸潤、血管壁增厚。替米沙坦作為半衰期最長的受體拮抗劑，能夠持久平穩(wěn)地抑制AngⅡ，從而減少炎癥因子的表達(dá)、腎小球系膜炎癥細(xì)胞的浸潤[16]。

替米沙坦是一種高活性高選擇性的血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）受體拮抗劑，AngⅡ通過與血管、腎臟、心臟、腎上腺上的AT1受體結(jié)合發(fā)揮其作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，替米沙坦治療后能顯著下調(diào)高表達(dá)的ICAM-1和VCAM-1，同時(shí)腎小球病理改變減輕，尿蛋白和血清肌酐明顯下降，從而提示替米沙坦可直接或間接通過降低ICAM-1和VCAM-1表達(dá)，改善糖尿病大鼠腎臟病變。然而，替米沙坦究竟是通過哪些環(huán)節(jié)影響ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)，尚有待于進(jìn)一步闡明。

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