趙海軍，張萬江，吳 芳，王 萍，吳江東，李春柱，孟憲杰

[（1石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科；2石河子大學醫(yī)學院病理生理學教研室/（新疆地方與民族高發(fā)病）教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002]

多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）是危重病救治中最重要的臨床問題和主要死亡原因。急性肺損傷（acute pulmomary damage，APD）在MODS中出現(xiàn)早、發(fā)生率高，臨床上表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）[1]。巨噬細胞是參與APD、ARDS與MODS的主要效應(yīng)細胞，APD、ARDS與MODS發(fā)生的原因之一就是巨噬細胞凋亡延遲[2-5]。在APD發(fā)生的炎癥級聯(lián)反應(yīng)過程中，一方面，通過巨噬細胞的激活、脫顆粒和呼吸爆發(fā)，導(dǎo)致了組織細胞的炎癥損傷，進而導(dǎo)致APD、ARDS與MODS的發(fā)生；另一方面，巨噬細胞凋亡的延遲也參與了APD、ARDS與MODS的發(fā)生和發(fā)展[2～5]。補體C3a 作為重要的前炎性介質(zhì)，起炎癥啟動和放大作用；補體C3a參與了包括APD、ARDS與MODS等在內(nèi)的許多炎性疾病的進程。有研究顯示[6～8]，補體C3a既可促使巨噬細胞脫顆粒和呼吸爆發(fā)，還能協(xié)同其它介質(zhì)進一步活化白細胞；同時，補體C3a還可通過影響巨噬細胞凋亡而參與APD、ARDS與MODS的發(fā)生和發(fā)展；為此，本實驗通過探討研究補體C3a對巨噬細胞凋亡的影響，為APD、ARDS與MODS救治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 流式細胞儀（BECKMAN-COULTER XL4美國），CO2恒溫孵箱（RKJ，日本），超凈工作臺（中國上海），臺式高速離心機（Sigma），倒置顯微鏡（Nikon，日本）

1.1.2 主要試劑 rhC3a和Histopaque 1077/1119（Sigma），Annevix-V FITC and PI 凋亡試劑盒（Beckman Coulter），RPMI-1640 培養(yǎng)基（含 100 U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素，10%的胎牛血清，20 mmol/L的L-谷氨酰胺）胎牛血清（Gibco）。

1.2 方法

1.2.1 人巨噬細胞培養(yǎng)與制備 THP-1細胞株購自中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所。細胞生長培養(yǎng)基采用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，每周換液2次。取對數(shù)生長期的細胞用于試驗，臺盼蘭染色做活細胞測定，活細胞比率大于95%。試驗前離心細胞，重懸于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，調(diào)整細胞濃度為1×106/mL。加入PMA使其終濃度為60 ng/mL，48 h后細胞分化貼壁，更換新鮮培養(yǎng)液。

光鏡下見分化前THP-1單核細胞呈球形，懸浮生長并呈無限制繁殖。加入佛波脂（PMA）72 h后，見細胞全部貼壁生長，呈不規(guī)則形狀，體積明顯增大，伸出偽足，提示巨噬細胞形成。

1.2.2 實驗分組 計數(shù)巨噬細胞數(shù)量，調(diào)整巨噬細胞濃度為1×106/mL，在含不同刺激劑的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃、5%二氧化碳的條件下培養(yǎng)，分組實驗。實驗分4組：補體C3a濃度為0.5μg/mL的巨噬細胞刺激組、補體C3a濃度為1μg/mL的巨噬細胞刺激組、補體C3a濃度為2μg/mL的巨噬細胞刺激組和空白對照組。

1.2.3 巨噬細胞凋亡的定量檢測 用4℃的PBS洗滌待測的巨噬細胞2次，用100μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為 1×106/mL，取100μL的細胞懸液于5mL流式管中，加入5μL Annexin V/FITC和5μL 20μg/mL的PI液，搖勻后于室溫避光孵育15min，在反應(yīng)管中加入400μL結(jié)合緩沖液，1 h、7 h、24 h分別上流式細胞儀檢測巨噬細胞凋亡指數(shù)，1 000個/s，總共檢測10 000個。

1.2.3 統(tǒng)計分析 結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行雙因素析因分析、單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人巨噬細胞培養(yǎng)與制備

人THP-1細胞培養(yǎng)，懸浮生長，呈圓形（圖1，2）。

圖1 人THP-1細胞培養(yǎng)照片（10×10）

圖2 人THP-1細胞培養(yǎng)照片（10×40）

人THP-1細胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)后培養(yǎng)照片，貼壁生長，呈梭形（圖 3，4）。

圖3 人THP-1細胞加入PMA 48 h后培養(yǎng)照片（10×40）

圖4 人THP-1細胞加入PMA 48 h后培養(yǎng)照片（10×40）

2.2 補體C3a依濃度對人巨噬細胞凋亡的影響

以補體C3a濃度為0.5、1和2μg/mL的人巨噬細胞刺激組，其對人巨噬細胞的凋亡率分別為（37.90±2.09）%、（34.52±2.27）%和（32.47±1.65）%；與凋亡率為（57.13±2.89）%的空白對照組相比，均有明顯的差異（P＜0.01）；依補體C3a濃度人巨噬細胞凋亡率呈下降趨勢，0.5μg/mL與2μg/mL組對比有差異（P=0.04＜0.05）；詳見圖 5所示。

圖5 不同濃度補體C3a刺激人巨噬細胞7 h后其凋亡率的變化（n=3）

2.3 補體C3a刺激依時間對人巨噬細胞凋亡的影響

圖6顯示：空白組7 h凋亡率為（59.63±2.46）%，24 h后升至（72.15±3.57）%，兩者對照有顯著差異；補體 C3a組7h凋亡率（34.81±2.28）%，24 h后升至（42.17±3.82）%，兩者對照有差異。圖6顯示，補體C3a組與空白組比較，7 h至24 h凋亡率增加的幅度變小，且有統(tǒng)計學差異。

圖6 補體C3a刺激人巨噬細胞隨時間其凋亡率的變化（n=3）

3 討論

巨噬細胞是參與APD、ARDS與MODS的主要效應(yīng)細胞，APD、ARDS與MODS發(fā)生的原因之一就是巨噬細胞凋亡延遲[2～5]。巨噬細胞的凋亡控制著炎癥反應(yīng)的時間和強度，巨噬細胞凋亡的調(diào)節(jié)是炎癥的進展和消退的關(guān)鍵因素，而凋亡紊亂與包括APD、ARDS與MODS在內(nèi)的多種急慢性炎癥性疾病相關(guān)[9，10]。研究證實，APD、ARDS與 MODS發(fā)病時滲出至肺組織的巨噬細胞存在凋亡延遲[3]；PARSEY[11]通過動物實驗研究證實，在炎癥早期巨噬細胞凋亡是受抑制的。SOOHAI[4]發(fā)現(xiàn)，隨著巨噬細胞凋亡的增強，缺血/再灌注損傷導(dǎo)致的肺損傷程度明顯減輕。TAKESHI[5]研究發(fā)現(xiàn)，使用連續(xù)性腎臟替代治療技術(shù)，可通過清除患者血清炎癥因子（IL-1，IL-8，TNF-α）明顯改善巨噬細胞的凋亡延遲，且與組織器官損傷評分相關(guān)的。

補體C3a是補體系統(tǒng)級鏈反應(yīng)的終末產(chǎn)物，由86個氨基酸組成，補體C3a通過其受體補體C3aR而產(chǎn)生生物學效應(yīng)。C3a為重要的前炎性介質(zhì)，起炎癥啟動和放大作用，補體C3a參與了包括MODS、ARDS與APD等在內(nèi)的許多炎性疾病進程[6～8]。補體C3a趨化巨噬細胞，也可直接或間接活化巨噬細胞釋放彈性蛋白酶、活性氧和炎癥因子等而損傷肺組織[12]，創(chuàng)傷后發(fā)生APD、ARDS與MODS的患者血漿和支氣管灌洗液中補體C3a濃度顯著增高，且其升高的水平與患者的創(chuàng)傷評分呈正相關(guān)[13]。

本實驗結(jié)果顯示，補體C3a能明顯抑制人巨噬細胞凋亡，且隨濃度增加抑制作用有增強的趨勢，與既往的實驗結(jié)果相一致；本實驗不論對照組和刺激組的凋亡率和已有實驗相比均明顯升高，這與以往較多實驗是使用PI染色主要觀察晚期凋亡，而本實驗使用Annevix-PI雙染色法，可同時檢測早中晚期凋亡有關(guān)。此外，應(yīng)用不同濃度的補體C3a刺激，其凋亡率無顯著差異。一方面，提示補體C3a濃度為0.5μg/mL，刺激已達飽和濃度，另一方面，也可能是刺激時間短，抑制作用體現(xiàn)不足。此外，樣本數(shù)少也可能使差異未顯現(xiàn)。

本實驗還顯示：巨噬細胞凋亡隨時間而增加，7 h凋亡率為（59.63±2.46）%，24 h時即升至（72.15±3.57）%，兩者對照有顯著差異；但24 h的巨噬細胞凋亡增加幅度明顯為低。補體C3a刺激7 h組凋亡率（34.81±2.28）%，隨著補體C3a刺激時間的延長，其抑制巨噬細胞凋亡的作用持續(xù)存在，24 h后升至（42.17±3.82）%；與補體C3a刺激7 h相比，24 h的巨噬細胞凋亡顯著增加，但幅度也明顯為低。這與本實驗的空白對照組和已有實驗結(jié)果趨勢相一致。上述結(jié)果顯示了補體C3a刺激后巨噬細胞凋亡存在時間依賴關(guān)系。

綜上所述，本研究顯示補體C3a抑制巨噬細胞凋亡存在濃度及時間依賴關(guān)系；補體C3a延長巨噬細胞的炎性反應(yīng)的時間，可能由此導(dǎo)致炎癥失控和消散延遲，從而參與了APD、ARDS與MODS的發(fā)生發(fā)展。

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