李永偉，楊宏志，郭云蔚，陸慧瓊，凌小強(qiáng)

（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1中醫(yī)科，2消化內(nèi)科，3中心實(shí)驗(yàn)室，4感染病科，廣東 廣州 510630）

甘草類制劑如甘利欣、復(fù)方甘草甜素（olycyrrhizin，GL）可影響 HBV 復(fù)制或抗原分泌[1～3]，甘草甜素是中藥甘草中的主要有效成分。基礎(chǔ)和臨床研究表明，GL具有抗炎、抗纖維化、降酶、退黃及免疫調(diào)節(jié)等作用，被廣泛用于治療各種急慢性肝炎。某些研究者認(rèn)為，GL可誘生干擾素抑制HBV[1，2]。目前在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）是激活后產(chǎn)生干擾素的重要信號分子，可促進(jìn)抗病毒的細(xì)胞免疫，具有抑制病毒復(fù)制的作用[3]。本實(shí)驗(yàn)研究了GL體外對HBeAg的作用及對TLR4信號分子的影響，以了解該藥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM 培養(yǎng)基（GIBCO公司），G418和MTT（Sigma公司），胎牛血清（ GBico公司），96孔、6孔培養(yǎng)板及25 cm2培養(yǎng)瓶（COSTER公司），酶標(biāo)儀（BIO-RAD、Model 450 MICRoPLATE READER），ELISA試劑盒購自中山生物公司，Real-time PCR檢測試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因公司，甘草甜素GL（商品名：美能）由日本美能生源制藥公司生產(chǎn)，TLR4抗體購自eBioscience公司，HepG2.2.15細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存。其他試劑來自于廣東省肝臟疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及藥物濃度設(shè)定

將GL按原藥物濃度用DMEM倍比稀釋成5個濃度梯度：800、400、200、100、50μg/mL；并設(shè)空白對照組。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2.2.15細(xì)胞鋪于六孔板，接種于DMEM混合培養(yǎng)液（含1O%胎牛血清、G418 200μg/mL），置5%二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，每3天換液一次，每孔加培養(yǎng)液至2mL，第5、6天加入相應(yīng)劑量GL，共2次。 第7天收集細(xì)胞行流式細(xì)胞儀檢測，每劑量組3個復(fù)孔，分3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)完成。

1.4 細(xì)胞存活率測定

藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)系通過MTT法測定細(xì)胞存活率。細(xì)胞接種于96孔板，接種第5，6天給藥，第7天加入1mg/mL MTT液每孔20μL，于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，每孔加入DMSO 200μL。細(xì)胞存活率%=實(shí)驗(yàn)孔OD值/對照孔OD值×100%。

1.5 檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBeAg水平

取收集的上清液，用ELISA法檢測，按試劑盒說明書操作，含量直接用OD值表示。

1.6 直接免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測TLR4表達(dá)

給藥后第7天收集細(xì)胞，加DMEM培養(yǎng)基1 000 r/min 離心 3～5min，去掉培養(yǎng)基，500μL PBS重懸細(xì)胞，取100μL細(xì)胞懸液，分別加TLR4標(biāo)記抗體各 10μL，混勻，避光孵育 20～30min，加 PBS 2 mL，2 000 r/min離心 5min，棄上清，加 1mL PBS 重懸上機(jī)，同型對照加無關(guān)抗體消去本底。

1.7 熒光定量PCR檢測TLR4 m RNA的表達(dá)

培養(yǎng)至第七天收集細(xì)胞并提取總RNA（Qiagen RNeasy Mini Kit，Gene copmpany），逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，#K1621，F(xiàn)ermatas），兩步法定量PCR（SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）Kit TaKaRa，DRR041S，寶生物工程（大連有限公司））檢測TLR4的表達(dá)水平。β-actin：正向引物：TGGCACCCAGCA CAATGAA,反向引物：CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA；TLR4正向引物:TCAGGTCCAGGTTCTTG GTTGAG,反向引物:AGGATGATGCCAGGATGATGTC。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GL對HepG2.2.15細(xì)胞增殖活性的影響

結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖活性隨GL量的增加，由促進(jìn)增殖而變?yōu)橐种圃鲋常摧^小劑量促進(jìn)細(xì)胞生長。其中，50μg/mL組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05；200μg/mL 以下三組間差異不顯著，P＞0.05；400μg/mL以上劑量則開始變?yōu)橐种萍?xì)胞增殖，400μg/mL與800μg/mL分別與其它各組比較差異有顯著性，P＜0.01。尤其是800μg/mL更為明顯，存活率只有20.7%。見表1。本結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致[1]。

2.2 不同劑量GL干預(yù)后細(xì)胞培養(yǎng)上清HBeAg的表達(dá)

HBeAg的表達(dá)結(jié)果顯示，GL各劑量組給藥后第7天總體均數(shù)間差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；200μg組以下雖然降低，但與對照組比較無顯著差異；400μg以上組HBeAg升高，但與對照組比較無顯著差異；800μg/mL組較 100、200μg/mL組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。見表1。

2.3 GL治療各組及對照組TLR4陽性細(xì)胞率的表達(dá)

治療后48 h流式細(xì)胞儀檢測TLR4陽性細(xì)胞率的表達(dá)，各組表達(dá)TLR4的陽性細(xì)胞率總體均數(shù)間差別有統(tǒng)計學(xué)意義。各劑量組與對照組比較，顯示表達(dá)TLR4的陽性細(xì)胞率均顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），尤其100μg/mL組最明顯，與其他各組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

2.4 GL治療各組及對照組TLR4mRNA的表達(dá)

治療后RT-PCR檢測TLR4 mRNA的表達(dá)，各組表達(dá)TLR4水平總體均數(shù)間差別有統(tǒng)計學(xué)意義。各劑量組與對照組比較顯示TLR4水平均顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），尤其100μg/mL組最明顯，與其他各組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 GL對HepG2細(xì)胞的影響

2.5 GL干預(yù)后各指標(biāo)的相關(guān)性

GL干預(yù)后，MTT結(jié)果與HBeAg呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.584,Sig=0.003）；TLR4 mRNA 與 TLR4 流式結(jié)果呈顯著正相關(guān)（r=0.881，Sig=0.000）。TLR4 mRNA及TLR4流式結(jié)果分別與MTT、HBeAg比較無相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）。

3 討論

TLR為I型跨膜蛋白，是連接先天和后天免疫的關(guān)鍵信號分子。TLR參與機(jī)體免疫反應(yīng)，可促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放、促使免疫細(xì)胞成熟、分化，調(diào)節(jié)適度水平的免疫應(yīng)答，因而可起到抗病毒的作用[4]，但也引起肝臟損傷。近來的研究顯示，TLR信號系統(tǒng)可能在肝臟疾病包括丙型病毒（HCV）性肝炎的發(fā)生及免疫介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中起重要作用。其中，HCV的蛋白成分可直接調(diào)節(jié)TLR家族的信號分子，是HCV持續(xù)感染的機(jī)理之一[5]。HBV的核心抗原可促使人類的THP-1巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，這一作用依賴于TLR2介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子的激活[6]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HBeAg可下調(diào)TLR2的表達(dá)[7，8]。但TLR2與其配體在乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠沒有抗病毒作用，而TLR4與其配體則可有效抑制病毒[3]。在免疫低下的慢乙肝患者，可出現(xiàn)肝細(xì)胞TLR的表達(dá)并直接導(dǎo)致肝損傷，提示TLR信號途徑激活產(chǎn)生IFN的同時，也可能激活了炎癥因子導(dǎo)致肝細(xì)胞的病理性損害[9]。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，在HBV持續(xù)感染的HepG 2.2.15細(xì)胞株TLR2、TLR4表達(dá)降低，表明HBV慢性感染可能需要TLR的低表達(dá)以逃避免疫清除，而GL可上調(diào)TLR水平，以100μg/m L組最為顯著，但200μg/m L組作用較其它組弱[10]；本研究與既往研究不同的是200μg/m L組對TLR4的調(diào)節(jié)仍較強(qiáng)，可能與兩次研究所用細(xì)胞株不同有關(guān)，此次為HBV野生型的細(xì)胞株。

在臨床病例中發(fā)現(xiàn)，慢乙肝輕度患者血清IL-2、IFNγ基本正常,但隨著炎癥的加重逐漸減少,慢性重型肝患者濃度則最低，上述Th1類細(xì)胞因子的低表達(dá)是病毒不能清除的原因之一[11]。有人認(rèn)為，GL抗病毒的機(jī)理可能與誘生干擾素有關(guān) ，干擾素產(chǎn)生的重要途徑為TLR信號家族途徑，GL有可能通過影響TLR信號分子的表達(dá)來促進(jìn)干擾素產(chǎn)生。李金興研究了GL對單個核細(xì)胞的影響，其產(chǎn)生干擾素的最適劑量為100μg/mL12]。我們兩次結(jié)果均提示100μg/mL組表達(dá)TLR2、TLR4的陽性細(xì)胞數(shù)最多[10]，可能與干擾素的產(chǎn)生有一定關(guān)系。

GL對TLR4的上調(diào)可能有助于打破慢乙肝的免疫耐受狀態(tài)，通過調(diào)節(jié)先天免疫而激活抗病毒效應(yīng)。MATTEO認(rèn)為，在缺乏適應(yīng)性免疫的情況下，先天免疫如TLR信號家族并不能顯著的導(dǎo)致肝臟損傷及病毒清除[13]，與GL體外非免疫細(xì)胞介導(dǎo)抑制Alexander細(xì)胞表面抗原[14]不同的是，如GL在體內(nèi)激活免疫細(xì)胞的TLR，可進(jìn)一步誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞免疫，從而促進(jìn)HBV清除，并且因GL具有抗炎作用，在抑制HBV的同時如何減輕TLR導(dǎo)致的病理損傷，需要進(jìn)一步研究其作用機(jī)理及其中的復(fù)雜關(guān)系。

本文還研究了GL對HepG2.2.15細(xì)胞株抗原分泌的作用，發(fā)現(xiàn)GL既可能抑制、也可能促進(jìn)e抗原分泌，即對HBV的抗原分泌具有雙向作用，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)還研究了GL對細(xì)胞增殖的影響，我們采用最后兩天持續(xù)給藥的方法，發(fā)現(xiàn)GL對細(xì)胞株增殖的影響與文獻(xiàn)其它給藥方法產(chǎn)生的結(jié)果類似，表現(xiàn)為中小劑量促進(jìn)增殖，大劑量抑制細(xì)胞增長[1]，其機(jī)理需要深入研究。

[1]楊 京,喻成波,席宏麗等.甘草甜素聯(lián)合單磷酸阿糖腺苷對HepG2.2.15細(xì)胞及其HBsAg表達(dá)的影響 [J].貴州醫(yī)藥,2006,30(6):483-485.

[1]YANG J,YU CB,XI HL,et al.Effects of GL combined with Ara-AMP on HBsAg expression and survival rate of HepG2.2.15 cell lines[J].Gui Zhou Medical Journal,2006,30(6):483-485.Chinese

[2]宋星宏.甘草甜素治療慢性乙型肝炎療效觀察[J]．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,1997,17(8):494-495.

[2]SONG XH.The observation of effect of Types of Chronic Hepatitis B treated with glycyrrhizin[J].Chinese Journal of Integrative Medicine.1997,17(8)494-495.Chinese

[3]MASANORI I,MICHAEL D.R,YOSHIHIRO F,et al.Toll-Like Receptor Signaling Inhibits Hepatitis B Virus Replication In Vivo[J].Journal of Virology,2005,6:7269-7272

[4]BIEBACK K,LIEN E,KLAGGE IM,et al.Hemagglutinin protein of wild-type measles virus activates toll-like receptor 2 signaling[J].J Virology,2002,76(17):8729-8736.

[5]KUI LI,EILEEN FOY,JOSEPHINE C.ERREON,et al,Immune evasion by hepatitis C virus NS3_4A protease-mediated cleavage of the Toll-like receptor3 adaptor protein TRIF [J].Proceedings National Academy Science of USA,2005,102(8):2992-2997.

[6]COOPER A,TAL G,LIDER O,et al,Cytokine Induction by the Hepatitis B Virus Capsid in Macrophages Is Facilitated by Membrane Heparan Sulfate and Involves TLR2[J].Journal Immunology,2005,175(5):3165-3176.

[7]RIORDAN SM,SKINNER N,KURTOVIC J,et al,Reduced Expression of Toll-Like Receptor 2 on Peripheral Monocytes in Patients with Chronic Hepatitis B [J].Clinical Vaccine Immunology,2006,13(8):972–974.

[8]VISVANATHANK K,SKINNER NA,THOMPSON AJ,et al,Regulation of Toll-Like Receptor-2 Expression in Chronic Hepatitis B by the Precore Protein[J].Hepatology,2007,45(1):102-110.

[9]TAKEHARA T,SUZUKI T,OHKAWA K,et al.Viral covalently closed circular DNA in a non-transgenic mouse model for chronic hepatitis B virus replication [J].Journal of Hepatology,2006,44(2):267-274.

[10]李永偉,楊宏志,柯千山,等.甘草甜素對HBsAg低表達(dá)HepG2.215細(xì)胞株HBV感染及TLR2、4的影響 [J].中藥材,2008,31(3):403－407.

[10]LI YW,YANG HZ,KE QS,et al.OF Glycyrrhizin on the Expression of Hepatitis B Virus and Toll Like Receptors 2,4 in HepG2.2.15 Cells Expressing Low HBsAg[J].Journal of Chinese Medicinal Materials,2008,(3):403－407.Chinese

[11]鐘旬華,李澤松,張國良,等.應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)觀察慢性肝病患者血清細(xì)胞因子的變化規(guī)律 [J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2007,14(5):267-270.

[11]ZHONG XH;LI ZS;ZHANG GL，et al.Application of protein chip technology for investigation of changes of various serum cytokines in patients with chronic hepatopathy[J].Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine in Intensive and Critical Care,2007,14(5):267-270.Chinese

[12]李金興 郭履峒 甘草甜素對新生兒臍血單個核細(xì)胞產(chǎn)生γ—干擾素的影響 上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報[J].1991,18(2):104-108.

[12]LI JX,GUO LZ.Effect of Glycyrrhizin on the Interferon Production of Human Neonatal Cord Blood Mononuclear Cells[J].Journal of Fudan University (Medical Science),1991,18(2):104-108.Chinese

[13]MATTEO I,GIOVANNI S,ZAVERIO M.RUGGERI,et al,HBV pathogenesis in animal models:recent advances on the role of platelets[J].J Hepatol,2007,46(4):719–726.

[14]FUJISAWA K,et a1．Therapcutic approach to chronic active hepatitis with Glycyrrhizin[J]．Asian Med J,1980,230:745.