鄭蘭娟，林俊揚(yáng)，林俊芳，郭麗瓊

1(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系廣東 廣州，510640) 2(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)能研究所，廣東廣州，510640)3(福建省莆田市農(nóng)科所，福建莆田，351144)

轉(zhuǎn)基因草菇高產(chǎn)多功能纖維素酶的培養(yǎng)條件*

鄭蘭娟1，2，林俊揚(yáng)3，林俊芳1，2，郭麗瓊1，2

1(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系廣東 廣州，510640) 2(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)能研究所，廣東廣州，510640)3(福建省莆田市農(nóng)科所，福建莆田，351144)

以轉(zhuǎn)多功能纖維素酶基因(mfc)草菇子代中單孢分離獲得的高產(chǎn)多功能纖維素酶菌株TVM186為研究對象，分析固態(tài)發(fā)酵對該工程菌株產(chǎn)多功能纖維素酶(MFC)的影響。通過單因素試驗(yàn)分析麩皮粉、大豆粉、香蕉皮粉等對MFC活性的影響，確定發(fā)酵主要影響因子為麩皮粉和大豆粉，適宜配比為質(zhì)量比1∶1;利用均勻設(shè)計(jì)分析發(fā)酵條件對該菌株產(chǎn)MFC的影響，結(jié)果表明:草菇工程菌株TVM186固態(tài)發(fā)酵的適宜培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)基起始pH值7.4，接種量6%，溫度34℃，時(shí)間10 d，含水量64%，裝料量18.5 g，其酶活力可達(dá)到木聚糖酶(Xylanase)1 427.38 U/g、內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(CMCase)597.59 U/g。

草菇，固態(tài)發(fā)酵，木聚糖酶，內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶，多功能纖維素酶

纖維素酶是能把纖維素分解成葡萄糖和其他化學(xué)物質(zhì)的酶的總稱［1－2］，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、飼料、能源、造紙、紡織等行業(yè)［3－8］。目前纖維素酶的生產(chǎn)存在著產(chǎn)酶量低，酶成分單一，培養(yǎng)濾液分解天然纖維素能力差等問題;而且纖維素酶是誘導(dǎo)酶，在其生產(chǎn)中要求培養(yǎng)基含有各種原料來為產(chǎn)酶提供必需的C、N源或誘導(dǎo)物，但成分過多，不僅會(huì)增加原料成本，還會(huì)降解單位酶活，使得纖維素酶在纖維素資源的轉(zhuǎn)化及食品工業(yè)、畜牧業(yè)上的應(yīng)用受到限制［9－12］。固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶可以選用任何的天然纖維素廢棄物，而且產(chǎn)量一般比液態(tài)發(fā)酵高出2～3倍，因此可以大幅度降低成本［13－14］，并且通過優(yōu)化培養(yǎng)，可以降低纖維素酶生產(chǎn)成本［15］。

多功能纖維素酶(MFC)是從草食性軟體動(dòng)物福壽螺的胃液中分離純化得到的一種纖維素酶，該酶同時(shí)具有外切β-1，4-葡聚糖酶，內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶和內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶等3種活性，能同時(shí)降解纖維素和半纖維素［16］。本課題組從福壽螺的組織細(xì)胞中克隆多功能纖維素酶基因(mfc)［17］，采用多種啟動(dòng)子在灰蓋鬼傘、銀耳芽孢、草菇中進(jìn)行了表達(dá)研究［18］。本研究是在以草菇gpd啟動(dòng)子連接mfc轉(zhuǎn)化草菇經(jīng)過篩選獲得轉(zhuǎn)基因草菇工程菌株(另文報(bào)道)，通過轉(zhuǎn)基因草菇的培養(yǎng)種植，在轉(zhuǎn)mfc草菇子代中單孢分離并篩選得到的高產(chǎn)多功能纖維素菌株TVM186的基礎(chǔ)上，以廉價(jià)的農(nóng)產(chǎn)品及其副產(chǎn)物作為發(fā)酵培養(yǎng)基，通過篩選最佳的固體發(fā)酵培養(yǎng)基及室內(nèi)發(fā)酵條件，以期獲得草菇mfc工程菌株高產(chǎn)MFC的發(fā)酵培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

草菇工程菌株TVM186，從轉(zhuǎn)多功能纖維素酶基因(mfc)草菇的子代中分離并篩選獲得，為高產(chǎn)菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、瓊脂 20 g、水 1 000mL。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基:稻草粉、麩皮粉、玉米粉、黃豆粉、香蕉皮粉、甘蔗渣粉或菠蘿皮粉10 g，分別加20mL自來水混勻，pH自然。

1.1.3 主要試劑

燕麥木聚糖(X0627)為Sigma公司產(chǎn)品，羧甲基纖維素鈉，3，5-二硝基水楊酸，酒石酸鉀鈉，NaOH，無水Na2SO3、水飽和酚及原料均為國產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶活測定方法

參照文獻(xiàn)［19］測定。

1.2.2 培養(yǎng)方法

將活化好的菌種以4%～6%的接種量接種于已滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)數(shù)天后，自來水浸提，5 000 r/min離心20 min，取上清液作為供試樣品，測定酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)料對產(chǎn)酶的影響

采用麩皮粉、玉米粉、甘蔗渣粉、稻草粉、菠蘿皮粉、黃豆粉和棉籽殼粉等作為單一培養(yǎng)料進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)，以木聚糖酶(Xylanase)和內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(CMCase)酶活力作為評(píng)價(jià)MFC酶活力的指標(biāo)。結(jié)果表明(圖1)，麩皮粉作為單一培養(yǎng)料時(shí)菌株的產(chǎn)酶量顯著高于其他培養(yǎng)料，其Xylanase、CMCase分別達(dá)到1 008.72 U/g，362.14 U/g。其次是黃豆粉，Xylanase、CMCase 分別達(dá)到 586.41 U/g，277.79 U/g，而其他幾種培養(yǎng)料其酶活力水平與麩皮相比都較低，菠蘿皮粉及甘蔗渣粉為培養(yǎng)料時(shí)沒有檢測到酶活，可能是菠蘿皮屬于酸性物質(zhì)，而草菇適合在偏堿性的環(huán)境中生長;甘蔗渣中殘留的蔗糖等物質(zhì)，可能對草菇的生長和產(chǎn)酶具有抑制作用，故草菇在以菠蘿皮粉及甘蔗渣粉為培養(yǎng)料時(shí)產(chǎn)MFC酶活很低，很難檢測到酶活。

圖1 不同培養(yǎng)料對產(chǎn)酶的影響

2.2 復(fù)合培養(yǎng)料對產(chǎn)酶的影響

為了進(jìn)一步提高酶活，對單一的麩皮培養(yǎng)料中添加其他成分，進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)料的固體發(fā)酵。圖2是麩皮添加等量的其他培養(yǎng)料進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)的試驗(yàn)結(jié)果，由圖2可知黃豆粉和麩皮粉復(fù)合培養(yǎng)產(chǎn)酶最顯著，其Xylanase、CMCase 分別達(dá)到 1 299.58 U/g，421.85 U/g，比單一麩皮成分Xylanase提高了22.89%，CMCase提高了14.17%。

圖2 復(fù)合培養(yǎng)料對菌株產(chǎn)酶的影響

為了優(yōu)化復(fù)合培養(yǎng)基中黃豆粉和麩皮粉的比例，圖3顯示了添加不同比例的黃豆粉和麩皮粉的復(fù)合培養(yǎng)試驗(yàn)的結(jié)果。以適當(dāng)比例添加黃豆粉有利于菌株的產(chǎn)酶:當(dāng)黃豆粉:麩皮粉組分比(質(zhì)量比)為2∶8時(shí)，其產(chǎn)酶量與單一的麩皮培養(yǎng)料相當(dāng)，當(dāng)組分比調(diào)整至5∶5時(shí)，酶活力產(chǎn)生較大增幅，增幅為菌株以麩皮作為單一培養(yǎng)料時(shí)產(chǎn)酶量的12%～30%;繼續(xù)增加黃豆粉的量不能使產(chǎn)酶量增加。原因可能是:在麩皮培養(yǎng)基中適量添加黃豆粉，改善了固體培養(yǎng)基質(zhì)的通氣及散熱條件，較利于菌株的生長和MFC的合成，但當(dāng)黃豆粉的量增加而麩皮的量減少時(shí)，麩皮中所含有的宜于菌株利用的生長因子的量隨之減少，從而導(dǎo)致菌株產(chǎn)酶量大幅降低。故選擇m(麩皮粉):m(黃豆粉)=1∶1做為最適復(fù)合培養(yǎng)料配比。

圖3 復(fù)合培養(yǎng)料配比對菌株產(chǎn)酶的影響

2.3 固態(tài)發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響

以復(fù)合培養(yǎng)料［m(麩皮粉)∶m(黃豆粉)=1∶1］作為固體發(fā)酵培養(yǎng)基，采用均勻設(shè)計(jì)表U10×(108)安排試驗(yàn)，考察不同的培養(yǎng)溫度(℃)、pH值、含水量(%)、裝料量(g)、接種量(%)及培養(yǎng)時(shí)間(d)對菌株產(chǎn)酶(Xylanase，CMCase)的影響，每個(gè)處理重復(fù)2次，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

利用SAS8.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。通過逐步回歸考察對Y起顯著影響的因子，剔除對Y的影響不顯著的因子，得到 Y1與因子 X1、X2、X3、X4、X5、X6之間的回歸方程為Y1=906.2× X1+570.9×X2－95.5×X3－51.4×X4－171.3×X5－32.8×X1X1+153.6×X1X2－390.7×X2X2+2.8×X1X3－11094。Y2與因子 X1、X2、X3、X4、X5、X6之間的回歸方程為Y2=444.2×X1+256.0×X2－39.95×X3－22.7×X4－73.2×X5－15.3×X1X1+70.8×X1X2－180.1× X2X2+1.2× X1X3－5 726.4。

表1 均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表1可以看出第5次試驗(yàn)的發(fā)酵條件是10次試驗(yàn)中最好的，即34℃、pH值9.5、含水量67%、裝料量11 g、接種量4%、培養(yǎng)10 d。這個(gè)最佳發(fā)酵條件和最優(yōu)發(fā)酵條件常常是很接近的。上面得到的回歸方程一般僅在試驗(yàn)范圍內(nèi)成立，通過回歸旋轉(zhuǎn)分析得出xylanase理論最優(yōu)發(fā)酵條件為:34℃、pH值7.4、含水量62%、裝料量18.5 g、接種量6%、培養(yǎng)9.5 d，Y1值為1 453.68 U/g。CMCase理論最優(yōu)發(fā)酵條件為34℃、pH7.4、含水量 64%、裝料量 18.5 g、接種量6%、培養(yǎng)9.5 d，Y2值為672.26 U/g。因?yàn)閄ylanase、CMCase是多功能纖維素酶表現(xiàn)出來的不同酶活性，其發(fā)酵條件應(yīng)是相同的，故確定多功能纖維素酶固體發(fā)酵條件為:34℃、pH值7.4、含水量為64%、裝料量18.5 g、接種量6%、培養(yǎng)10 d。

2.4 驗(yàn)證結(jié)果分析

經(jīng)SAS軟件逐步回歸，得出最高指標(biāo)時(shí)各個(gè)因素組合為 X1=34℃、X2=7.4、X3=64%、X4=18.5 g、X5=6%、X6=10 d，此時(shí) Xylanase、CMCase 最高酶活應(yīng)為1 453.68 U/g、672.26 U/g。經(jīng)驗(yàn)證，在如上條件下3次實(shí)驗(yàn)的平均結(jié)果為:xylanase、CMCase酶活分別為1 427.38 U/g、597.59 U/g，與回歸的理論值基本偏差不大。說明該方法對草菇工程菌株TVM186發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化是可行的。

3 討論與結(jié)論

纖維素酶是誘導(dǎo)酶，培養(yǎng)基中纖維素的含量直接影響纖維素酶的產(chǎn)生。課題組對其培養(yǎng)基進(jìn)行大量的摸索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)麩皮作為單一培養(yǎng)料時(shí)菌株產(chǎn)酶量顯著高于其他單一培養(yǎng)料，原因是麩皮中含淀粉、纖維素、半纖維素、有機(jī)氮及生長因子等豐富營養(yǎng)物質(zhì)［20］可促進(jìn)菌絲的生長，所含的纖維素和半纖維素可能對酶的合成具有誘導(dǎo)作用，故其在麩皮培養(yǎng)基上生長情況較好，很多研究者的研究結(jié)果也表明了這一點(diǎn)［21－22］。黃豆粉不適合菌絲生長，但與麩皮粉的混合有利于產(chǎn)酶。因此，麩皮粉和黃豆粉的混合物是草菇TVM186菌株發(fā)酵的理想培養(yǎng)基。

纖維素酶的生產(chǎn)有固體發(fā)酵和液體深層發(fā)酵兩種方法，前者無論是產(chǎn)量上還是質(zhì)量上均優(yōu)于后者，固體發(fā)酵比液體發(fā)酵具有更高的產(chǎn)率，D.S.Chahal通過對文獻(xiàn)已報(bào)道的2種發(fā)酵工藝產(chǎn)率的分析比較，發(fā)現(xiàn)固態(tài)發(fā)酵酶產(chǎn)率(250～430 IU/g纖維素)比液態(tài)發(fā)酵酶產(chǎn)率(160～250 IU/g纖維素)增加約72%［23］。在我們的研究過程中，也同時(shí)對 TVM186菌株的液體發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明:固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，TVM186菌株的 Xylanase酶產(chǎn)率提高了75%，CMCase酶產(chǎn)率提高了86%。由于目前國內(nèi)外應(yīng)用的產(chǎn)纖維素酶的菌種大多系真菌，真菌習(xí)性在靜止條件下生產(chǎn)，并要求菌絲體緊密接觸纖維素類物質(zhì)，故而在液體攪拌中生長不良。纖維素基質(zhì)是不溶性的，亦不利于液態(tài)發(fā)酵。在液態(tài)攪拌發(fā)酵中，真菌在發(fā)酵罐內(nèi)只長菌絲體，真菌不同部位分泌的酶的酶組分存在差異，故而液體發(fā)酵酶組分沒有生長完全的固體發(fā)酵酶組分豐富和比例適當(dāng)。故本試驗(yàn)最終確定采用固體發(fā)酵作為MFC的發(fā)酵途徑。

通過均勻設(shè)計(jì)分析，草菇TVM186菌株在34℃，pH值7.4，含水量64%，裝料量18.5 g，接種量6%，培養(yǎng)10 d的條件下，Xylanase和 CMCase的酶活分別可達(dá)到1 427.38 U/g、597.59 U/g，比優(yōu)化前分別提高了9%和29%。

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Culture Conditions of Transgenic Volvariella volvacea for High Production of Muli-Functional Cellulase

Zheng Lan-juan1，2，Lin Jun-yang3，Lin Jun-fang1，2，Guo Li-qiong1，2
1(Doparenent of Bioengineering College of Food Science，South China Agricultanol Vuiversity，Guangzhou 510640，China)2(Lnstitute of Bionass Research，South China Agricultural Vniversity，Guangzhou 510640，China)3(The lnstitute of Agriculture Science，Putian 351144，China)

TVM186 with high MFC activity was separated by monospore isolation from the transformants of Volvariella volvacea.Solid substrate fermentation was performed to investigate the optimum fermentation conditions for enzyme production of the transgenic V.volvacea.Several single factors on fermentation of strain TVM186 were studied in this research.The result showed that the optimum culture conditions of solid state fermentation were wheat bran power and soybean power with allocated proportion is 1∶1.The optimum solid state fermentation conditions of TVM186 were initial pH 7.4，inoculation 6%，temperature 34℃，fermentation time 10 d，water ratio 64%，substrate 18.5 g using uniform design experiment.The highest Xylanase and CMCase activity were 1 427.38 U/g and 97.59 U/g respectively.

Volvariella volvacea，solid substrate fermentation，Xylanase，CMCase，Muli-Functional Cellulase

碩士研究生(郭麗瓊教授為通訊作者)。

*國家863項(xiàng)目(2006AA10Z301);“十一五”國家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目子課題(2008ADA1B02);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30871768)資助

2010－04－14，改回日期:2010－07－27