王超群，谷方紅，段開紅

1(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特，010018)2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

不同酒花中多酚物質(zhì)的測(cè)定

王超群1，谷方紅2，段開紅1

1(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特，010018)2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

利用高效液相色譜法檢測(cè)酒花中12種小分子多酚的含量。該方法的緊密度和準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性好，最低檢出限小于1.0 mg/L，加標(biāo)回收率均大于92%，RSD%小于5%，說明該方法準(zhǔn)確可靠。用該方法對(duì)18種酒花顆粒中的12種多酚物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

高效液相色譜，酒花，多酚

多酚物質(zhì)是羥基直接連接在芳環(huán)上的酚類及聚合物的總稱。按其分子量分布分為單寧類化合物(相對(duì)分子量為500～3 000)和非單寧類化合物(分子量＜500，＞3 000)。本文主要是針對(duì)分子量＜500的酚類物質(zhì)做研究，包括酚酸化合物、黃酮醇類化合物、兒茶酸類化合物以及花色素原。

分子量小于500的酚類物質(zhì)對(duì)啤酒是有利的，如酒花中的酚酸類物質(zhì)有利于啤酒的口味，單體多酚及低聚體具蹂化力，能沉淀麥汁中高分子蛋白，提高啤酒的非生物穩(wěn)定性。近代啤酒工業(yè)對(duì)多酚的研究結(jié)果表明，啤酒釀造過程中多酚的影響是利大于弊。所以，保留適量的多酚比除去多酚顯得有利，啤酒中比較合適的總多酚含量在110～130 mg/L。

不同酒花品種所提供的多酚物質(zhì)是不同的［1］。檢測(cè)不同酒花中的小分子多酚的種類及含量，有利于指導(dǎo)啤酒生產(chǎn)中酒花的添加，給予啤酒特殊的風(fēng)味［2］。

本文主要對(duì)哈拉道、卡斯卡特、努革特等18種酒花顆粒中的12種小分子多酚進(jìn)行檢測(cè)，確定這12種小分子多酚的含量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

甲醇:HPLC級(jí)色譜純;乙腈:HPLC級(jí)色譜純;甲酸:分析純;水為超純水。

香草酸、咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、原兒茶酸、龍膽酸、沒食子酸、芥子酸、綠原酸、槲皮素、山奈酚、蘆丁12種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品:均購于百靈威。

18種90型顆粒酒花分別為:德國哈拉道地區(qū)的PERLE(HPE)、HALLERTAU(HHA)、HALLERTAU TAURUS(HHT)、HERSBRUCK(縮寫HHE))、SPALT(HSE)、SAPHIR(HSA)、HALLERTAU MAGNUM(HHM);蒂特南地區(qū)的 TETTNANG(TTE)、美國(2005 年)的VANGUARD、CLUSTER、GALENA、TOMAHAWK、MILLENNIUM、甘肅天馬(2009年)的哈拉道、卡斯卡特、馬努革特、青島大花、Barth公司(2009年)的捷克薩茲(CSA)。

1.2 主要儀器

導(dǎo)津LC-vt高效液相色譜儀;ZORBAX SB－C18柱;醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器;電子分析天平;真空泵;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;紫外可見分光光度計(jì)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

準(zhǔn)確稱取多酚標(biāo)樣12.5 mg，用甲醇分別定容到25mL容量瓶中，將標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液置于－20℃冰箱中保存，使用時(shí)再用甲醇稀釋到所需濃度。

2.2 樣品的提取

取5g酒花顆粒溶于100mL的60%丙酮水溶液中，20℃下，在醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器中超聲30 min，經(jīng)減壓濃縮后，將殘?jiān)苡?mL甲醇中，用0.45 μm的濾膜過濾后，存于冰箱中備用。

2.3 色譜條件［3－5］

色譜柱:安捷倫 ZORBAX SB－C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm);柱溫:30℃;流速:1mL/min;進(jìn)樣:10.0μL;檢測(cè)波長:280 nm;流動(dòng)相 A:5%甲醇(含0.1%甲酸)水溶液，B:5%乙腈(含0.1%甲酸)甲醇溶液;洗脫梯度:0～15 min，26%B;15～30 min，40%B;40～50 min，65%B;50～60 min，0%B。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 檢測(cè)波長的選擇

由紫外可見分光光度計(jì)在200～400nm波長范圍內(nèi)掃描，確定多酚物質(zhì)在 265、280、300、320nm 處均有最大吸收，所以在這4個(gè)波長下對(duì)多酚物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。在吸收波長為300 nm時(shí)，各標(biāo)準(zhǔn)品的分離效果、峰型最好，且各種酚都得到了完全分離。而其他3個(gè)波長下，酚類物質(zhì)沒能完全檢測(cè)出。實(shí)驗(yàn)選用300 nm為多酚物質(zhì)的檢測(cè)波長。

3.2 流動(dòng)相的選擇

檢測(cè)多酚物質(zhì)的流動(dòng)相一般有甲醇水溶液、乙腈水溶液、乙腈-甲醇水溶液、甲醇-四氫呋喃水溶液、乙腈-四氫呋喃水溶液等幾種［6］。根據(jù)分離效果，選用乙腈-甲醇水溶液為流動(dòng)相。

僅用甲醇水作流動(dòng)相很難實(shí)現(xiàn)標(biāo)樣的完全分離，因此在甲醇溶液中加入了少量的乙腈，來實(shí)現(xiàn)多酚物質(zhì)的完全分離，如圖1和圖2所示。

圖1 十二種多酚物質(zhì)標(biāo)樣的HPLC圖譜

圖2 十二種多酚物質(zhì)標(biāo)樣在改變HPLC條件后的分離圖譜

考慮到酚類化合物常帶有酚羥基，在水中會(huì)部分解離，而未解離的羥基與固定相作用較強(qiáng)，容易導(dǎo)致拖尾［7］。酸性條件下酚類物質(zhì)的電離被抑制，成為中性分子在反相條件下的疏水締合物，分離效果和峰型明顯改善［8］?？紤]到色譜柱的pH范圍，所以流動(dòng)相A和B中均加0.1%甲酸。

圖1和圖2相比，圖1的分離效果不如圖2，并且出峰時(shí)間時(shí)間較長，所以將流動(dòng)相B制為5%乙腈(0.1%甲酸)的甲醇溶液。

3.3 線性范圍和檢出限

在多酚物質(zhì)線性范圍內(nèi)(1～20 mg/L)，配制一系列不同濃度的標(biāo)樣混合溶液(n=6)，以標(biāo)樣峰面積對(duì)濃度(mg/L)進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)樣的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以S/N=3為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得各標(biāo)樣的最低檢出限。結(jié)果如表1中所示。

表1 多酚物質(zhì)的回歸方程［A3］、檢出限

3.4 回收率和精密度

該方法的加標(biāo)回收率及精密度如表2所示。

表2 多酚物質(zhì)的加標(biāo)回收率、RSD

3.5 樣品的測(cè)定

3.5.1 樣品中多酚物質(zhì)的定性

將酒花中提取出的多酚物質(zhì)在已確定的多酚檢測(cè)條件下進(jìn)樣，其分離圖譜見圖3。

將標(biāo)樣與圖3比較，可以確定酒花中沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、槲皮素、山奈酚、龍膽酸等12種多酚物質(zhì)的含量。

圖3 酒花樣品分離圖譜

3.5 不同酒花品種中各多酚物質(zhì)的含量

用2.2方法制備的多酚提取液，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，得到18種酒花中12中多酚物質(zhì)的含量，如表3所示。從表3中數(shù)據(jù)可以看出，在12種酚類物質(zhì)中，酒花中以蘆丁、槲皮素和山奈酚等物質(zhì)的含量較高。

表3 不同酒花品種中各多酚物質(zhì)的含量 mg/mL

4 結(jié)論

用60%丙酮水溶液提取法——高效液相色譜法檢測(cè)酒花中的12中多酚物質(zhì)，選擇適宜的檢測(cè)波長，通過調(diào)節(jié)流速、柱溫等參數(shù)，可以把酒花中的酚類物質(zhì)較好的分離，各酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性，能夠用于定量分析。用該方法檢測(cè)了18種顆粒酒花中的12種多酚物質(zhì)的含量。并且和文獻(xiàn)中相對(duì)應(yīng)的酒花的多酚含量進(jìn)行了比較，所得到的數(shù)據(jù)是可靠的。

這12種多酚在各酒花中的含量不一，總體來說，蘆丁、槲皮素以及山奈酚的含量較高，其次是龍膽酸和阿魏酸，其他的多酚在顆粒酒花中的含量都很少。

由于酒花中的酚酸類物質(zhì)有利于啤酒的口味，單體多酚及低聚體具蹂化力能沉淀麥汁中高分子蛋白，提高啤酒的非生物穩(wěn)定性。所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)于啤酒的生產(chǎn)具有一定指導(dǎo)意義，根據(jù)酒花中酚酸類物質(zhì)含量，選擇適當(dāng)?shù)木苹ㄆ贩N，可以改善啤酒的口味。根據(jù)單體多酚及低聚體含量，選擇合適的酒花，能夠改善啤酒的渾濁現(xiàn)象，提高啤酒的非生物穩(wěn)定性。

［1］陳霞.多酚物質(zhì)對(duì)啤酒穩(wěn)定性的影響［J］.廣州食品工業(yè)科技，2002，65(1):25－27.

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［3］Koen Goiris，Evelien Syryn，Barbara Jaskula，et al.Hop polyphenols:potential for beer flavour stability［J］.Proceedings of the 30th EBC Congress PRAGUE，2005，157:1 331－1 341.

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［5］杜麗娟，薛潔，王異靜.反相高效液相色譜法測(cè)定獼猴桃酒中的多酚物質(zhì)［J］.釀酒，2008(1):72－74.

［6］孫承峰，姜竹茂，楊建榮.反相高效液相色譜法測(cè)定蘋果多酚的含量［J］.食品工業(yè)科技，2006(7):182－189.

［7］李苗苗，于淑娟.黃酮類化合物現(xiàn)代分析方法概述［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(7):119－122.

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Determination of Polyphenols in Different Hops

Wang Chao-qun1，Gu Fang-hong2，Duan Kai-hong1
1(College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China)2(China National Research Institute of Food ＆ Fermentation Industries，Beijing 100027，China)

high performance liquid chromatographic(HPLC)method for determination of small molecule polyphenols in hops was established in this paper.The detection limit of this method was under 1.0mg/L，and the recoveries of the polyphenols were all above 92%and relative standard deviation were all bellow 5%，which suggested that the method was accurate.And using the method in determination of 12 polyphenols in 18 kinds of hops.

HPLC，Hops，Polyphenols

碩士。

2010－08－16，改回日期:2010－06－25