劉晨晨，張虹，戴志遠(yuǎn)，梁新樂

(浙江工商大學(xué)食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江杭州，310035)

魚片干輻照加工處理的鑒別

劉晨晨，張虹，戴志遠(yuǎn)，梁新樂

(浙江工商大學(xué)食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江杭州，310035)

以魚片干為研究對象，采用高效液相色譜-熒光檢測法研究酪氨酸含量與輻照殺菌處理的關(guān)系。建立了樣品提取、分離和濃縮的前處理方法和液相檢測方法，并提出以鄰酪氨酸和對酪氨酸含量的比值作為判定樣品是否輻照的標(biāo)準(zhǔn)。方法檢出限為16.6～21.0 ng/mL。對酪氨酸和鄰酪氨酸在16～3 800 ng/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系(R2=0.999 7～0.999 9)，樣品加標(biāo)回收率(n=3)分別為82.7%～98.3%和83.3%～93.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)＜7.8%。

魚片干，高效液相色譜，輻照，鄰酪氨酸，對酪氨酸

食品輻照技術(shù)是20世紀(jì)發(fā)展起來的一項(xiàng)滅菌保鮮技術(shù)［1－3］，在糧、蔬、果、肉、調(diào)味品、中藥等領(lǐng)域已有應(yīng)用。我國輻照食品產(chǎn)量已占全球總量的1/3，并具備輻照食品分類的相關(guān)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)和工藝標(biāo)準(zhǔn)。2009年我國發(fā)生了2例因鈷(60Co)放射源機(jī)械故障引起的輻照室內(nèi)貨物自燃事件;同年，某品牌方便面調(diào)料包因沒有標(biāo)注國標(biāo)規(guī)定的輻照標(biāo)識(shí)而遭到消費(fèi)者的起訴。至此，輻照食品的營養(yǎng)和衛(wèi)生安全性問題一躍成為消費(fèi)者關(guān)注的焦點(diǎn)。食品經(jīng)輻照處理后會(huì)發(fā)生生物、物理和化學(xué)變化［4］，國際上對輻照食品的安全問題也一直存在爭議，相關(guān)輻照食品的檢測方法也有待完善。因此，研究簡便、快捷、準(zhǔn)確的檢測方法，對制定相應(yīng)的輻照食品分析技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。

富含蛋白質(zhì)的食品在輻照過程中產(chǎn)生微量的鄰酪氨酸，通過檢測該類食品中鄰酪氨酸的含量可以判定食品是否經(jīng)過輻照處理。早期，鄰酪氨酸的檢測主要是通過將樣品酸水解，衍生化或直接經(jīng)反相高效液相色譜分離檢測［5－8］。原有的方法存在衍生化產(chǎn)物不穩(wěn)定、試劑昂貴、檢測條件極端、緩沖鹽體系易損傷色譜柱等缺點(diǎn)。此外，酸水解還會(huì)帶來諸如基質(zhì)復(fù)雜化、重現(xiàn)性差、強(qiáng)酸性樣品溶液縮短色譜柱壽命等問題［9］。Hein等人［10］在對輻照蝦肉的研究中發(fā)現(xiàn)，通過檢測游離鄰酪氨酸可以避免酸水解帶來的諸多問題。本文以魚片干為研究對象，對樣品中游離酪氨酸及其異構(gòu)體的提取、分離、檢測方法進(jìn)行研究，旨在建立一套樣品前處理和檢測方法，為魚片干類樣品的輻照鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

各品牌魚片干購于杭州華潤萬家超市、歐尚超市和世紀(jì)聯(lián)華華商超市。魚片干粉碎后于－18℃密封保存。

鹽酸、氫氧化鈉(分析純)，DL-鄰酪氨酸(DL-otyrosine，簡稱 o-tyr) ＞ 98%(Alfa aesar)，DL-間酪氨酸(DL-m-tyrosine，簡稱 m-tyr):購于 Sigma 公司，L-對酪氨酸(L-p-tyrosine，簡稱 p-tyr)，純度＞99%購于上海生工;甲酸、甲醇、乙酸(色譜純，美國Merck)，超純水(Millipore)。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204分析天平(瑞士Mettler Toledo梅特勒-托利多公司)，90-2定時(shí)恒溫磁力攪拌器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)，高速粉碎機(jī)(上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司)，循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工有限公司)，NEOCOOL冷凍干燥機(jī)(日本yamato科技公司)，Sorvall RC-6 Plus離心機(jī)(美國 Thermo公司)，Waters2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)，帶Waters2996熒光檢測器，Milli-Q純水裝置(美國MILLIPORE公司)，Empowers色譜工作站，0.45μm微孔濾膜(杭州英譜科技發(fā)展有限公司)，KQ-5200E超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)。

1.3 色譜條件

色譜柱:漢邦，C18(250 mm ×4.6 mm，5μm);梯度洗脫(表1)，流動(dòng)相:甲醇(含0.2%甲酸)(A)+水(含0.2%甲酸)(B):柱溫:30℃;流速:0.8mL/min;進(jìn)樣量:5.0μL;熒光檢測器激發(fā)波長:275nm。發(fā)射波長:305 nm。

表1 梯度洗脫程序

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

分別準(zhǔn)確稱取 p-tyr、m-tyr、o-tyr標(biāo)準(zhǔn)品0.003 2、0.004 1、0.003 8 g，加0.2%甲酸水溶液溶解，于200mL容量瓶中定容，配成 p-tyr、m-tyr、o-tyr濃度分別為:1.60×104、2.05×104、1.90×104ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃冰箱保存。分別移取1mL儲(chǔ)備液，于100mL容量瓶定容，加0.2%甲酸水溶液定容，配制成6個(gè)不同濃度的混標(biāo)溶液。

1.5 樣品處理

準(zhǔn)確稱取3.00 g試樣于50mL燒杯中，加入30mL0.2%甲酸水溶液，室溫下磁力攪拌2h(避光操作)，抽濾，收集濾液，用10%NaOH調(diào)pH值至中性，冷凍干燥。凍干后樣品復(fù)溶于0.2%甲酸水溶液5mL，13 000 r/min 離心 20 min，上清液過 0.45μm 微孔濾膜，待液相色譜檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件選擇

由于目標(biāo)物質(zhì)易溶于甲酸，選擇甲酸水溶液與文獻(xiàn)中使用的溶劑0.1mol/L HCl為提取溶劑。各稱取3.00g粉碎的魚片干樣品于50mL燒杯中，分別加入30mL 0.2%甲酸(FA)水溶液、0.1mol/L HCl，按1.5所述所述方法進(jìn)行提取，利用高效液相色譜法測定各酪氨酸異構(gòu)體含量，重復(fù)3次。提取效果如表2所示。

表2 提取效果比較

從表2中可以看出，0.2%FA的提取效果略優(yōu)于0.1mol/L HCl，故采用前者作為提取溶劑。

以0.2%FA 作提取溶劑，按照(g∶mL)1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15 的料液比提取目標(biāo)物質(zhì)，最終確定最適料液比為1∶10。

按照1.5所述方法，比較了攪拌時(shí)間30 min、1、1.5、2、2.5、3 h對提取效率的影響，確定最佳提取時(shí)間為兩個(gè)小時(shí)。

2.2 流動(dòng)相的選擇

酪氨酸的溶解度受pH值影響很大，其在常規(guī)色譜柱上的保留時(shí)間較短。以往常用的緩沖鹽體系為流動(dòng)相雖能達(dá)到有效分離，但對色譜柱造成損傷，儀器的清洗也較為復(fù)雜;用甲酸和乙酸為流動(dòng)相代替緩沖鹽減少對色譜柱的損傷，簡化儀器清洗程序，同時(shí)可較好地增加目標(biāo)物溶解度、改善峰型、提高分離度。本研究分別在流動(dòng)相中加入一定比例的甲酸和乙酸，比較其效果。結(jié)果表明，相同濃度下甲酸比乙酸的效果更好。甲酸濃度在0.9%～0.2%內(nèi)時(shí)對各目標(biāo)物質(zhì)的保留時(shí)間影響不大。由于甲酸是強(qiáng)酸，考慮到色譜柱的耐受性，實(shí)驗(yàn)最終確定流動(dòng)相甲酸濃度為0.2%。

圖1 不同濃度甲醇等度及梯度洗脫色譜圖

酪氨酸是弱極性化合物，其各異構(gòu)體在色譜柱上的保留隨流動(dòng)相中甲醇含量的增加而減弱。如圖1(A)、圖1(B)所示，當(dāng)流動(dòng)相甲醇含量為25%時(shí)，ptyr、m-tyr、o-tyr的保留時(shí)間依次是:3.74、4.20、5.42 min。3種異構(gòu)體在色譜柱上的保留時(shí)間很接近，分離度欠佳。當(dāng)甲醇含量降至10%時(shí)，保留時(shí)間依次延遲至5.26、6.39和9.241 min。各峰間距離增大，但峰寬變大。為了進(jìn)一步提高分離度，同時(shí)保證良好的峰型，最終采用了10%～25%甲醇的梯度洗脫方法，如圖1(C)所示。

2.3 檢測波長的選擇

固定發(fā)射波長305 nm，激發(fā)波長掃描范圍200～295;固定激發(fā)波長275 nm，發(fā)射波長掃描范圍285～400 nm，結(jié)果如圖2(A)、圖2(B)所示。

2.4 方法檢出限、線性范圍和相關(guān)性

將1.4所配6個(gè)濃度的混標(biāo)溶液按1.3所述液相條件進(jìn)樣，以濃度和峰面積做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比計(jì)算檢出限，以10倍信噪比計(jì)算定量限，結(jié)果如表3所示。

圖2 激發(fā)波長、發(fā)射波長3D掃描圖

表3 線性相關(guān)性及檢出限

2.5 方法回收率和精密度

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和可靠性，對本方法進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn)。向陰性樣品中分別添加3個(gè)濃度的o-tyrosine和p-tyrosine標(biāo)準(zhǔn)品，平行3次。結(jié)果如表4所示。

表4 加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)(n=3)

從表4中可以看出，在7.5×104～3.0×105ng/g的加標(biāo)濃度下，p-tyr的平均回收率在82.7%～98.3%之間，標(biāo)準(zhǔn)偏差＜4.9%;在149～596 ng/g的加標(biāo)濃度下，o-tyr的平均回收率在83.3～93.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)偏差＜7.8%。

2.6 實(shí)際樣品中的檢測

圖3(A)、圖3(B)分別顯示的是已知未經(jīng)輻照和已經(jīng)過輻照處理的魚片干樣品色譜圖。圖3中未輻照組的o-tyr含量明顯低于輻照組。

圖3 輻照(B)和未輻照(A)樣品樣品游離酪氨酸液相色譜圖

圖4 混合標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

為了更準(zhǔn)確地制定魚片干輻照處理的判斷指標(biāo)，本研究組在各大超市購買了6個(gè)品牌的魚片干，進(jìn)行相同處理，對游離酪氨酸進(jìn)行分析檢測。其結(jié)果如下表5所示。

表5 樣品酪氨酸檢測結(jié)果

由于o-tyr和m-tyr都是游離苯丙氨酸的產(chǎn)物，因而苯丙氨酸的濃度直接制約著產(chǎn)物酪氨酸的濃度［13］，所以直接以o-tyr含量判斷食品是否進(jìn)過輻照處理并不合理?？紤]到原材料和加工工藝差異對結(jié)果的影響，分別從含量和o-tyr/p-tyr(%)比值上比較輻照和未經(jīng)輻照的樣品。由于o-tyr占總酪氨酸的比例很小，因此可以近似認(rèn)為o-tyr/p-tyr比值的增加等同于 o-tyr含量的增加。Makoto Miyahara［7］等人在對輻照豬肉、牛肉、雞肉和金槍魚中蛋白態(tài)o-tyr的研究中發(fā)現(xiàn)，雞肉o-tyr的本底值明顯高于其他3個(gè)樣品，且其在相同輻照劑量下o-tyr的增加也明顯高于其余樣品，這說明品種間存在較大的差異性。在10kGy(60Co，6 kGy/h)劑量下，4種樣品的otyr含量增加至原來的2～3倍。Wolfgang，Thomas［10］等人研究蝦中游離o-tyr，未輻照蝦肉中游離otyr含量為 0.0561mg/kg、1.0、3.0，5.0 kGy 劑量下(137Cs，0.7 kGy/h)o-tyr含量分別是未輻照組的3.9、7.4、11.1倍。本研究中輻照組o/p=0.434%，是未輻照處理組(o/p=0.074 3%)的5.9倍，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類似。表5中，1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、6號(hào)4個(gè)品牌樣品o/p比值在3.15～5.71，5號(hào)、6號(hào)樣品的o/p比值分別是0.56和0.78。綜合結(jié)果，可以認(rèn)為o/p＜0.10%的魚片干是未經(jīng)輻照加工的，并以此作為判定魚片干未輻照的標(biāo)準(zhǔn)。即1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、6號(hào)樣品被判定為陽性樣品。對于各陽性樣品間o/p比值的差異，可能受樣品種類、輻照計(jì)量、時(shí)間和溫度等因素的影響［11－12］。

Krach［11］等人在研究火雞香腸、蛋清和蛋黃中游離酪氨酸時(shí)發(fā)現(xiàn)，輻照能同時(shí)增加m-tyr和o-tyr的含量，相同劑量時(shí)m-tyr的含量均明顯低于o-tyr［12］。在以上4個(gè)樣品中也能檢出微量的m-tyr，這一結(jié)果與本文研究結(jié)果一致。但是，m-tyr含量與o-tyr和p-tyr沒有明顯的計(jì)量關(guān)系，因此，只能作為定性判斷輻照與否的參考，而o-tyr和p-tyr的比值可以作為判斷輻照與否的依據(jù)。

3 小結(jié)

輻照引發(fā)魚片干中鄰酪氨酸含量的增加，其與對酪氨酸的比值明顯高于未輻照組，通過測定該比值可鑒定魚片干是否輻照。本文建立了一套包括游離氨基酸提取、分離和濃縮的樣品前處理方法和液相檢測方法。通過對輻照和未輻照樣品的檢測以及含量比較，判定o/p＜0.10%的魚片干是未經(jīng)輻照加工的。與以往研究相比，本文首次采用甲酸水溶液作為提取溶劑，提起效果優(yōu)于常用的0.1mol/L HCl;HPLC分析方法中甲酸水溶液作為流動(dòng)相兼具增加溶解度和抑制拖尾的效果，同時(shí)還可能降低使用緩沖鹽體系流動(dòng)相對色譜柱和儀器的損傷。該方法操作簡單、準(zhǔn)確度高，可用于魚片干類食品輻照的鑒定，為食品質(zhì)量與安全的監(jiān)督管理提供了有效的檢測方法。

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Identification of Irradiation Treatment of Dried Fish

Liu Chen-chen，Zhang Hong，Dai Zhi-yuan，Liang Xin-le
(College of Food Science and Biotechnology Engineering，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，China)

This paper investigated the relationship between tyrosin composition and irradiation sterilized dried fish.The tyrosin composition was determined by high performance liquid chromatogram－fluorescence detector.The method of sample preparation was also developed，including extraction，separation and concentration.The ratio of ptyr and o－tyr was used to identify whether sample was irradiated.The detection limit was 16.6～21.0 ng/mL.The linear range was from 16 ng/mL to 3 800 ng/mL，and linear correlation was good(R2=0.999 7～0.999 9).Recovery of o-tyrosine and p-tyrosine were 82.7% ～98.3%and 83.3%～93.8%，respectively.The relative standard deviation was less than 7.8%.

dried fish，high performance liquid chromatogram，irradiation，o-tyrosine，p-tyrosine

碩士研究生(張虹教授為通訊作者)。

2010－09－17，改回日期:2010－10－03