葉可萍，祝長青，2，周光宏

1(南京農業(yè)大學農畜產品加工與質量控制農業(yè)部重點開放實驗室，教育部肉品加工與質量控制重點實驗室，江蘇南京，210095)2(江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇南京，210001)

利用Taqman實時熒光PCR檢測市售肉制品中轉基因大豆成分*

葉可萍1，祝長青1，2，周光宏1

1(南京農業(yè)大學農畜產品加工與質量控制農業(yè)部重點開放實驗室，教育部肉品加工與質量控制重點實驗室，江蘇南京，210095)2(江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇南京，210001)

采用優(yōu)化的CTAB法提取肉制品中的大豆DNA，利用Taqman探針Real-time PCR檢測轉基因大豆成分的內外源基因。實驗表明，利用優(yōu)化的CTAB法提取肉制品中大豆基因組DNA，內源基因擴增良好;19種樣品中有7種檢測出CaMV 35S啟動子基因，5種檢測出RRS基因。首次揭示轉基因大豆成分在中國市售肉制品中的存在，轉基因大豆蛋白已進入下游肉制品加工鏈。

轉基因大豆，肉制品，實時熒光PCR

轉基因生物自1994年獲準推廣以來［1］，在食品中的應用已越來越廣泛，源于這些生物的各種食品也豐富，并走上人們的餐桌。與傳統(tǒng)食品不同，轉基因食品可能對人體健康和生態(tài)環(huán)境存在潛在影響［2－5］。雖然我國尚未允許種植轉基因大豆，但2008年我國進口大豆3 700萬 t，大部分為轉基因大豆(roundup ready soybean，RRS)已進入食品消費領域。大豆蛋白由于其獨特的營養(yǎng)特性與功能特性，作為肉品工業(yè)必不可少的成分，占據重要角色，成為最廣泛應用的植物蛋白。隨著國產大豆的緊缺，轉基因大豆越來越多地占據我國市場，由于美國大豆大部分是抗除草劑草甘膦轉基因大豆，轉基因里的成分很有可能進入到肉制品的加工鏈中。熒光定量PCR是新近出現的一種定量PCR檢測方法，主要有非特異性染料結合和熒光探針標記2種。目前應用較多的是Taqman探針法，它是在常規(guī)PCR反應體系中加入一個特異性的Taqman熒光標記探針，通過熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR反應進程［6］。由于Taqman探針Real-time PCR的特異性強、靈敏度高，因此近年來常被用于檢測食品中轉基因生物的基因成分。

目前，檢測轉基因大豆食品的技術路線通常為:首先對樣品進行大豆內源基因檢測并判斷DNA提取效果;其次對樣品進行篩選檢測并判定其結果為陽性或陰性;最后對篩檢陽性結果進行確認驗證并做出肯定或否定的判定［7］。Fábio 等［8］對巴西市場上含大豆蛋白質的肉食品添加劑的研究表明，32個食品添加劑樣本中25個樣本檢測到164 bp Lectin基因片段，15個樣本中檢測到抗草甘膦大豆的特異基因169 bp片段;在8種肉食品中檢測到Lectin基因，3種檢測到抗草甘膦大豆特異基因。Taski-Ajdukovic等［9］在塞爾維亞市場上銷售的51個肉制品中，利用Realtime PCR法發(fā)現其中12種可檢測到35S啟動子的195 bp片段。Paola等［10］在檢測大豆產品及可能含有大豆成分的加工品中發(fā)現6種香腸產品中有2種存在RR大豆DNA成分。Ralf等［11］抽查的100個樣品中21%含有轉基因成分，其中3種大豆分離蛋白中就有一種檢測到含外源基因。Gabriella等［12］調查匈牙利市場21種肉制品，均檢測到Lectin基因，同時定量檢測外源基因時發(fā)現，5種樣品轉基因成分含量＞5%，3種樣品轉基因成分含量在0.9%～5%，4種樣品轉基因成分含量＜0.1%。國外轉基因的大豆蛋白已作為食品成分在加工肉制品中商業(yè)化應用，對肉制品的安全性提出了新的挑戰(zhàn)。

隨著國產非轉基因大豆的緊缺，我國肉制品企業(yè)有可能應用含轉基因成分的大豆蛋白，但由于肉制品中大豆蛋白含量較少，且肉制品與大豆產品不同，屬于大豆下游食品鏈產品，因此有必要對市售肉制品中轉基因成分進行檢測。因此，調研市售肉制品中轉基因成分的存在狀況，可提供轉基因成分在我國肉制品鏈中加工及流通環(huán)節(jié)的信息，了解其在我國肉制品市場的分布現狀，為下游食品中轉基因成分的標識與追溯打下基礎，確保“從農田到餐桌”全程將轉基因與非轉基因產品分開和標識。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料與試劑

根據大豆蛋白在肉制品配料配方中的作用，購買6個企業(yè)的19種市售低溫肉制品(如香腸、火腿等)，于4℃保存，直至DNA提取。

實時熒光PCR反應的Premix預混液:TaKaRa DRR039A;標準物質:經過確認的轉基因大豆提取核酸后經驗證，稀釋到合適濃度用于檢測;引物和探針參照ISO 21570:2005和 GB19495.4－2004，由 TaKa-Ra公司合成，序列見表3;其他試劑均為分析純。

表1 本研究所用引物及探針

1.2 主要儀器與耗材

Roche LightCycler 480實時熒光PCR擴增儀，瑞典羅氏公司;Nanodrop 1000 Thermal核酸蛋白測定儀，美國熱電公司;Avanti J-E落地式高效冷凍離心機，美國Beckman Coulter公司;臺式冷凍離心機，AllegraTM64R Centrifuge，美國Beckman Coulter公司;96孔熒光PCR反應板;200、20、10μL濾芯槍頭;其他常規(guī)分子生物學實驗室儀器設備。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA提取

將GB/T 19495.3－2004中CTAB法進行改良優(yōu)化，提取樣品核酸。流程為:稱取5 g樣品，剪碎放于50mL離心管中，加入12.5mL CTAB提取緩沖液和39μL蛋白酶K(20mg/mL)，顛倒混勻后于65℃孵育混勻機中30 min;20 000 g離心10 min，提取上清液1mL于1.5mL離心管，加入2μL RNase A酶(100mg/mL)，60℃孵育15 min;18 000g離心3 min，取上清液700μL于1.5mL離心管;加入與上清液等體積的三氯甲烷，顛倒混勻后，20 000 g離心10 min，轉移上清液600μL于2mL離心管;加入2×體積CTAB沉淀液，顛倒混勻后，室溫靜置12 h;20 000 g離心10 min，棄去上清液，向沉淀中加入400μL NaCl溶液，使沉淀溶解;在溶解液中加入等體積三氯甲烷，顛倒混勻后，20 000 g離心10 min，轉移上層水相至1.5mL離心管中;加入0.6倍體積經4℃預冷的異丙醇，顛倒混勻后，于4℃下靜置30 min;4℃下20 000 g離心10 min，小心棄去上清液;加入750μL經4℃預冷的75%乙醇，傾斜離心管，輕輕轉動數圈后，4℃下20 000 g離心10 min，小心棄去上清液;用經4℃預冷的75%乙醇按相同方法重復洗1次。室溫下后放置揮干液體;加 50μL AE緩沖液(60℃預熱)溶解DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA濃度與純度測定

以AE緩沖液為空白調0，取2μL樣品，滴于Nanodrop核酸蛋白測定儀的鏡片上，對DNA濃度與純度進行測定。

1.3.3 Taqman探針實時熒光PCR

按表2配制實時熒光PCR反應體系。反應程序:第1階段預變性95℃/20 s;第2階段95℃/10 s、60℃/30 s，循環(huán)數55;第3階段40℃/20 s冷卻儀器。在第2階段的退火延伸時段收集熒光值，PCR反應結束后，根據收集的熒光曲線和Ct值判定結果。陽性對照以轉基因大豆的DNA溶液為模板;試劑空白對照(以水代替DNA模板)。每個樣品作2個重復。

2 結果與討論

2.1 肉制品中轉基因大豆成分核酸提取效果

肉制品是利用畜禽肉為主要原料，經調味制作的熟肉制成品或半成品［13］，它是一種混合物質，包含瘦肉、肥肉、添加劑、調味料等。利用優(yōu)化的CTAB法提取的核酸，經Nanodrop測定得到，樣品DNA濃度均大于50 ng/μL，A260/A280均在 1.8～2.0，提取的DNA均適合于PCR的擴增。

表2 Real-time PCR反應體系

2.2 大豆內源Lectin基因檢測

提取到一定數量的大豆基因組DNA是進行轉基因成分PCR擴增的前提條件，對被檢測樣品內標基因進行PCR擴增，是判斷食品組分和DNA提取質量的有效方法。大豆基因植物凝集素基因(Lectin)在大豆細胞中的表達量或在其基因組中的拷貝數是恒定的，受環(huán)境因素影響較小，其數量多少可作為大豆基因組大小的參照［14－17］。通過對 Lectin基因的擴增，可以判斷所提取大豆DNA是否適合于PCR擴增，避免假陰性結果的出現。從圖1可看到，試劑空白對照的熒光曲線平直，陽性對照出現典型的擴增曲線，表明反應體系工作正常。樣品同樣出現典型的擴增曲線，表明肉制品中大豆蛋白的基因組DNA可利用優(yōu)化的CTAB法及Real－time PCR得到檢測。

圖1 19種樣品Lectin內源基因擴增曲線

2.3 CaMV 35S啟動子基因檢測

篩選檢測主要是以轉基因植物的通用元件和標記基因作為特異性擴增片段［18］。由于相同的通用元件和標記基因常被用于多種轉基因植物的研究與生產，從而大大降低了篩選PCR檢測的特異性，只能用于轉基因植物檢測的初步篩選。檢測到這些通用元件只預示著檢測樣品中存在有轉基因成分。

CaMV 35S啟動子是轉基因大豆使用的啟動子，CaMV 35S啟動子基因存在于外源插入基因表達框架中，非轉基因植物中不存在該基因。因此，對CaMV 35S啟動子進行擴增可以對轉基因食品進行初篩，確定肉制品中是否存在轉基因成分。由圖2可看出，反應體系工作正常，部分樣品出現典型的擴增曲線，即檢測的19種肉制品中有7種擴增出CaMV 35S啟動子特異性片段。由結果可得，市售肉制品可能已受轉基因植物成分污染，對樣品進行初步的篩選。

圖2 19種樣品CaMV 35S啟動子基因擴增曲線

2.4 RRS基因檢測

構建特異性檢測是通過檢測外源插入載體中兩個元件的連接區(qū)DNA序列的擴增實現的，具有相對較高的特異性，能確證抗草甘膦轉基因大豆成分的存在。本研究選取35S與CTP的連接區(qū)RRS基因進行擴增確證。由圖3可看出，反應體系工作正常，部分樣品出現典型的擴增曲線，即檢測的19種肉制品中有5種擴增出RRS特異性片段。

3 討論

對市場上銷售的肉制品調查發(fā)現，市場上許多肉制品的配料表中均含有大豆蛋白，說明許多肉品加工企業(yè)添加一定量的大豆蛋白等增稠劑來提高其出品率。本試驗根據大豆蛋白在肉制品配料表中的位置，購買6個企業(yè)的19種市售低溫肉制品(如香腸、火腿等)，保證樣品中含有足夠檢的大豆蛋白用于檢測。

對于肉制品中RRS成分的檢測，需要高效率高質量的核酸提取方法。CTAB法主要通過CTAB分離緩沖液將DNA溶解出來，再經氯仿－異戊醇抽提除去蛋白質，最后得到DNA，適用于混合物的DNA提取。由于肉制品中物質比較復雜，且大豆蛋白含量較少(一般為2%～6%)［19］，因此有必要采取一些措施如提高取樣量、延長DNA沉降時間等來提高DNA提取效率。由結果可看出本試驗優(yōu)化的CTAB法適用于肉制品中大豆組織DNA的提取。同時，由于大豆蛋白已為大豆的加工品，在進入下游食品鏈時又經過肉制品的相關工藝過程，DNA可能發(fā)生不同程度的降解，選擇較短的DNA片段進行擴增是進行成功檢測的關鍵［20］。有研究發(fā)現，靶標序列在100 bp時可以抵御惡劣的加工工藝［21］。因此本試驗選取的擴增片段均小于100 bp，分別為Lectin(81 bp)、CaMV 35S(74 bp)和RRS(83 bp)，提高檢測的準確性。

本試驗選取南京市場上6個企業(yè)的19種市售肉制品，7種樣品擴增出CaMV 35S啟動子特異性片段，5種樣品擴增出RRS特異性片段，這5種產品中含轉基因大豆成分，僅擴增出CaMV 35S啟動子的產品可能含有轉基因植物。同時這些檢測出的轉基因陽性品并非來自同一個企業(yè)，說明國內有些肉品企業(yè)應用的大豆蛋白已含有轉基因成分。

4 結論

本試驗在南京市場選取的19種肉制品中有5種產品檢測出轉基因成分，說明我國市場中流通的一些大豆蛋白中含轉基因，我國肉制品企業(yè)應用了這些含轉基因成分的大豆蛋白，使其進入下游肉制品加工鏈，這對轉基因的標識與追溯提出了新的要求。同時抗除草劑草甘膦大豆(RRS)的大豆蛋白已作為食品成分在加工肉制品中商業(yè)化應用，也對肉制品的安全性提出了新的挑戰(zhàn)。

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Detection of Genetically Modified Soybean Ingredients in Meat Products by Taqman Real-time PCR

Ye Ke-ping1，Zhu Chang-qing1，2，Zhou Guang-hong1
1(Key Laboratory of Food Processing and Quality Control，Ministry of Agriculture/Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control，Ministry of education，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)2(Jiangsu Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210001，China)

This article used the cety-ltrimehyl ammonium bromide(CTAB)method with some modifications to extract DNA，endogenous and exogenous genes of genetically modified soybeans were detected using Taqman Realtime PCR.Nineteen samples of meat products containing soy proteins were tested for the presence of soybean amplifiable DNA using the CTAB extraction methods with modifications，all the samples gave a positive signal for the lectin gene，7 samples returned a positive signal for CaMV 35S promoter detection，and 5 samples for specific RR detection confirming the presence of genetically modified soybean.These results demonstrate for the first time the presence of RR soybean in meat products sold commercially in China，and genetically modified soybean proteins have got into the downstream chains of meat products.

genetically modified soybean，meat products，Real-time PCR

碩士研究生(周光宏教授為通訊作者)。

*農業(yè)部轉基因生物新品種培育重大專項課題:食品鏈中轉基因生物的溯源與污染評估模型的研究(2009ZX08012－014B)

2010－06－19，改回日期:2010－09－27