凌萍華，李清純，謝 晶

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

4-HR對涂膜南美白對蝦的黑變抑制和殘留量分析

凌萍華，李清純，謝 晶*

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

研究了0.002%4－己基間苯二酚（4－h(huán)exylresorcinol，4－HR）+1%殼聚糖（A組）、0.01%4－HR+1%殼聚糖（B組）和0.05%4－HR+1%殼聚糖（C組）在冷藏條件下對生鮮南美白對蝦黑變的抑制作用。測定了南美白對蝦的黑變感官評價值、多酚氧化酶活性（PPO）、菌落總數(shù)（TBC）、揮發(fā)性鹽基氮（TVB－N）和4－HR的殘留量。結(jié)果表明，在整個貯藏過程中，C組一直具有最低的多酚氧化酶活性和最低的黑變感官評分，但是在第4d 4－HR的殘留量已經(jīng)超過了1mg/kg；A和B組在4d內(nèi)黑變感官評分和酚酶活性無顯著差異（P＞0.05），兩組4－HR的殘留量分別在第8d和第6d超過1mg/kg，根據(jù)TBC、TVB－N的變化可知，A、B、C三組的貨架期分別為6、6和8d，而對照組1只有4d。一定濃度的4－HR與殼聚糖復(fù)配保鮮不僅能安全和高效地減緩南美白對蝦黑變進(jìn)程，而且能延長貨架期。

4－己基間苯二酚，南美白對蝦，黑變，殘留量

黑變是引起甲殼類動物感官品質(zhì)下降的重要原因，這會導(dǎo)致品質(zhì)下降、貨架期變短。黑變是由于蝦在死亡后，體內(nèi)色源物質(zhì)在多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的作用下發(fā)生了一系列的氧化和聚合反應(yīng)，生成了黑色的大分子物質(zhì)［1］。焦亞硫酸鈉曾作為最為有效的蝦類黑變抑制劑，后來由于有研究表明焦亞硫酸鈉能引起使用者發(fā)生哮喘等呼吸疾病，因而被美國、歐盟等地區(qū)禁止使用［2］。而南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）是很多發(fā)展中國家出口創(chuàng)匯的主要水產(chǎn)品，因此各國正在開發(fā)其他黑變抑制劑替代品，以達(dá)到改善南美白對蝦黑變快、腐敗快的現(xiàn)狀［3］。McEvilly等人［4］在1991年首先提出4－己基間苯二酚（4－HR）是蝦中酪氨酸酶的有效抑制劑，可安全取代亞硫酸鹽來抑制蝦類黑變。在1993年4－HR被納入我國添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB2760），作為專門用于防止蝦類黑變的食品添加劑（規(guī)定：殘留量＜1mg/kg）；1995年聯(lián)合國FAO/WHO將4－HR列為添加劑C類準(zhǔn)用名單（規(guī)定：殘留量＜1mg/kg）；歐盟推薦殘留量2mg/kg以下是安全的［5］。4－HR在食品行業(yè)“一般公認(rèn)為安全的”（Generally Recognized As Safe，GRAS），被各國作為可允許使用的抑制蝦類黑變的食品添加劑，所有國家對使用量均未做限制，但大部分國家對殘留量是有所限制的，因此將4－HR應(yīng)用于南美白對蝦防黑變保鮮必須檢測其殘留量。本文主要研究不同濃度的4－HR結(jié)合1%的殼聚糖對抑制南美白對蝦黑變和延長貨架期的效果，并進(jìn)行了4－HR殘留水平的檢測。

表1 實驗處理分組

表2 黑變感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

活體南美白對蝦 上海市南匯新蘆苑農(nóng)貿(mào)市場；4－己基間苯二酚 食品級，河南金潤食品添加劑有限公司；殼聚糖 食品級，脫乙酰度≥90%，購自上海恒生化工有限公司；其它試劑均 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Kjeltec2300凱氏定氮儀 丹麥福斯公司；2100型&UV－2100型分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；H－2050R－1高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；YXQ－LS－30SH全自動立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHP－9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 前處理 在購買地將鮮活南美白對蝦中放置少許冰塊，充氧氣包裝后保活運(yùn)輸至實驗室，立刻用碎冰使其休克失活，用清水洗凈。隨機(jī)分成五組，處理如表1，貯藏于（4±1）℃環(huán)境。

1.2.2 黑變感官評定 參照Montero的黑變評分細(xì)則［1］并稍作修改，由8個經(jīng)過培訓(xùn)的感官評定人員組成黑變感官評分小組，每2d評定一次，評分細(xì)則如表2。其中4～5分表示黑變已完全不可接受。

1.2.3 多酚氧化酶活性（PPO）測定 結(jié)合Simpson［6］和陳麗嬌［7］多酚氧化酶活性測定方法。單位：以每分鐘每毫升酶液引起吸光度值改變0.01為1個酶活力（U）。

1.2.4 揮發(fā)性鹽基氮（TVB－N） 利用半微量定氮法原理，采用凱氏定氮儀測定南美白對蝦的TVB－N變化［8］。

1.2.5 菌落總數(shù)（TBC） 根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 4789.2－2008中的平板計數(shù)法測定［9］，每個稀釋梯度計數(shù)三個平板，取其平均值。

1.2.6 4－HR殘留量檢測 綜合Smallwood1［10］和凌關(guān)庭［11］的方法并稍作改進(jìn)。

1.2.6.1 指示劑的制備 取可溶性淀粉1g，碘化汞10mg和適量冷水，混合成薄糊狀。加沸水200mL，在連續(xù)攪拌下煮沸1min。冷卻后，取透明溶液備用。

1.2.6.2 測定流程 稱取蝦肉5g，勻漿移入250mL碘量瓶中，加甲醇10mL溶解試樣。加溴/溴化物試液（TS－48）30mL，然后迅速加入鹽酸5mL，立即加塞。在流水下將碘量瓶冷至室溫，劇烈搖動5min，靜置5min。沿瓶塞四周加碘化鉀試液（TS－192）6mL，小心地緩緩松開塞子，再塞緊，緩緩搖動。加氯仿1mL，用0.1mol/L硫代硫酸鈉滴定釋出的碘，將臨終點時加上述指示劑溶液3mL。同時進(jìn)行空白測定。4－HR的含量計算式如下：

其中：B為空白測定中所消耗的0.1mol/L硫代硫酸鈉的mL數(shù)；S為測定試樣時所耗0.1mol/L硫代硫酸鈉的mL數(shù)；W為蝦肉重量（kg）。

1.2.7 統(tǒng)計方法 用SPSS 17.0（中文版）軟件對數(shù)據(jù)做方差分析；采用新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。采用origin Pro 8.0繪制數(shù)據(jù)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑變感官評價分

從表3黑變感官評分的方差分析可看出，這5種處理方式之間在第2d到第8d均存在顯著性差異（P＜0.05），5組的黑變評分在貯藏的8d內(nèi)均呈現(xiàn)增長趨勢；其中對照1和對照2增長最快，分別在第6d和第8d達(dá)到了評分表中的最高分?jǐn)?shù)，蝦體均幾乎全黑，并且汁液流失嚴(yán)重，肌肉發(fā)黃發(fā)臭，對照2的黑變分值的增加速度比對照1稍稍緩慢，可見醋酸表現(xiàn)了微弱的黑變抑制能力，可能是由于酸性使多酚氧化酶的pH環(huán)境發(fā)生改變，從而活性降低；A、B和C三個處理組的黑變分值增長速度相對于2個對照組明顯減緩，其中A和B組的黑變評分除了第6d外均無顯著差異（P＞0.05），因此黑變抑制效果類似，而C組的黑變分在整個貯藏過程均顯著低于A和B組（P＜0.05），表現(xiàn)了較強(qiáng)的黑變抑制能力，在第8d的黑變分值依然維持在4分以下的水平。這和Montero等人［5］報道的當(dāng)應(yīng)用于長吻對蝦的4－HR的濃度從0.01%提高到0.05%時，其黑變感官分增速顯著下降的結(jié)果是一致的。0.05%4－HR則表現(xiàn)出了較強(qiáng)的黑變抑制能力。

2.2 PPO活性

甲殼類水產(chǎn)品中存在的多酚氧化酶（PPO）是導(dǎo)致蝦死后黑變的主要原因，其活性變化能夠間接反映水產(chǎn)品黑變程度，測定PPO活性變化能更好地分析4－HR等保鮮劑的黑變抑制原理。圖1表明蝦無論經(jīng)過哪種處理方式保鮮，PPO活性在貯藏初期均呈下降趨勢，此時5個實驗組的變化幅度無顯著差異，這可能是由于蝦死亡后pH降低，低pH能顯著地影響酶－底物絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)性，從而降低PPO的活性和黑變程度［12］，還可能因為當(dāng)蝦從常溫變?yōu)槔洳丨h(huán)境，酶的活性隨著溫度的降低而下降；之后隨著貯藏時間的延長其活性不斷增強(qiáng)，從第2d開始，PPO活性由弱到強(qiáng)表現(xiàn)為：C組＜B組＜A組＜對照1＜對照2；并且在6～8d之間A、B、C組的PPO活性開始顯著小于另外兩個對照組，其中C組表現(xiàn)了最低的PPO活性，與黑變感官評分結(jié)果一致。

表3 黑變感官評分結(jié)果

表4 南美白對蝦的TBC（lg cfu/g）變化

圖1 南美白對蝦的PPO活性變化

2.3 TBC

根據(jù)GB2741－94規(guī)定：細(xì)菌總數(shù)≤5（lg cfu/g）為一級鮮度，≤5.7（lg cfu/g）為二級鮮度，當(dāng)細(xì)菌總數(shù)達(dá)到6（lg cfu/g）時，蝦已經(jīng)不能食用，以此判定貨架期終點［13］。從表4可以看出，3個處理組和2個對照組的TBC從第0d到第2d均表現(xiàn)為下降趨勢，這由于剛開始蝦體由常溫轉(zhuǎn)入冷藏環(huán)境，因此，一些嗜溫細(xì)菌的增長會被抑制；其中處理組相對于對照組下降最為明顯，B、C組的TBC下降速度無顯著性差異；之后5組的TBC均呈現(xiàn)增長趨勢，A、B、C組和對照2的TBC的增長速度慢于對照組1，均表現(xiàn)了一定的抑菌效果，這可能是由于貯藏初期，當(dāng)蝦體溫度恒定后，嗜冷細(xì)菌得以繼續(xù)存在，且持續(xù)增長，而醋酸、殼聚糖、4－HR可能均存在不同程度的抑菌作用，因此，TBC的變化會表現(xiàn)出一定差異，其中A、B組都是第6d超過二級鮮度，這和徐麗敏等人［14］研究的殼聚糖保鮮南美白對蝦的貨架期水平無顯著差異。C組的結(jié)果表明，當(dāng)復(fù)合保鮮劑的4－HR濃度提高至0.05%時，抑菌效果顯著優(yōu)于A、B組，Monsalve等人［15］也報道了當(dāng)4－HR的濃度達(dá)到一定值時，4－HR能顯著抑制細(xì)菌的生長。

2.4 TVB-N

圖2反映了5組南美白對蝦TVB－N的變化。新鮮南美白對蝦的TVB－N值為5mg/100g左右，TVB－N值在整個貯藏過程中呈現(xiàn)增長趨勢，對照組1在第4d即達(dá)到36mg/100g，而此時經(jīng)過醋酸處理的對照組2也達(dá)到了31mg/100g，均達(dá)到了貨架期的終點（GB2741－94規(guī)定：TVB－N（mg/100g）≤30為二級鮮度［13］）；實驗結(jié)果表明，復(fù)合了4－HR的涂膜組相對于對照1和對照2組均表現(xiàn)了一定的抑制TVB－N生成的效果，其中A、B組效果相似，C組最好。復(fù)合了4－HR的殼聚糖A、B組和徐麗敏等人［14］研究的未復(fù)合4－HR的殼聚糖的TVB－N變化是相似的，而C組與之比較卻有顯著差異，這表明當(dāng)4－HR的濃度較低水平時，主要是殼聚糖在抑制TVB－N的生成，而當(dāng)4－HR提高至一定濃度時，4－HR和殼聚糖均發(fā)揮了作用。TVB－N是水產(chǎn)品在細(xì)菌和酶作用下分解產(chǎn)生的氨及低級胺類物質(zhì)，因此上述結(jié)果再次表明了A、B、C組的抑菌效果。

圖2 南美白對蝦的TVB－N變化

2.5 4-HR殘留量

上述結(jié)果表明，一定濃度的4－HR復(fù)合殼聚糖涂膜的保鮮方式能有效抑制蝦的黑變進(jìn)程。雖然4－HR在國際上屬于GARS范疇。但大多數(shù)國家對4－HR殘留量有所規(guī)定，因此檢測其殘留量是必要的。表5是對使用了4－HR的A、B、C三組進(jìn)行了殘留量分析的實驗結(jié)果。結(jié)果顯示，A、B、C三個處理組的蝦肉中的4－HR的殘留量隨著時間的增加而增加，這可能是由于肌肉隨著時間的延長會不斷吸附4－HR，其中A組增長速度最小，在6d內(nèi)均維持在1mg/kg以內(nèi)，在貨架期的終點（第6d）的殘留量為0.76mg/kg，因此用濃度為0.002%4－HR處理后的南美白對蝦無殘留量超標(biāo)的安全性問題。而B組的4－HR殘留量隨著時間的增加稍高于A組，并且在第6d達(dá)到1.2mg/kg，剛過衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的最大限量值。而C組的4－HR殘留量的增長速度顯著快于A、B組，在第2d達(dá)到0.82mg/kg，第4d達(dá)到2.60mg/kg，在第8d飆升至31.97mg/kg，殘留量顯著增加。

表5 南美白對蝦的4－HR殘留量（mg/kg）變化

3 結(jié)論與討論

結(jié)合理化指標(biāo)和感官評定結(jié)果變化可知，在貯藏過程中，蝦的可食用品質(zhì)可能均未超標(biāo)時就已經(jīng)黑變很嚴(yán)重了，對于消費者而言，購買蝦時首先感受到的是蝦的外觀色澤，黑變的蝦自身經(jīng)濟(jì)價值顯著下降。對于對照組來說，1%殼聚糖復(fù)合不同濃度的4－HR的保鮮效果，與預(yù)實驗中單一應(yīng)用殼聚糖的實驗結(jié)果比較，其TVB－N、TBC等指標(biāo)的變化雖然沒有表現(xiàn)較大差異，貨架期水平也相似，但是其黑變抑制效果顯著，并且隨著4－HR濃度的增加而增強(qiáng)，綜合各個實驗組的貨架期、黑變抑制效果和4－HR殘留量可知，0.002%4－HR+1%殼聚糖（A組）或0.01% 4－HR+1%殼聚糖（B組）可以滿足改善冷藏蝦貨架期內(nèi)感官品質(zhì)的要求。

本文旨在用殼聚糖來保持蝦的食用品質(zhì)，用4－HR來抑制蝦的黑變，保持蝦的經(jīng)濟(jì)價值，但又不超出相關(guān)規(guī)范的殘留量規(guī)定。兩者的結(jié)合使用在目前國內(nèi)外研究中為初次嘗試，效果顯著，值得推廣應(yīng)用。

［1］Montero P，Martínez－álvarez O，Gómez－Guillén M C. Effectiveness of Onboard Application of 4－Hexylresorcinol in Inhibiting Melanosis in Shrimp（Parapenaeus longirostris）［J］. Journal Of Food Science，2004，69（8）：643－647.

［2］Collins－Williams C.Intolerance to additives［J］.Anal Allergy，1983，51：315－316.

［3］Nilesh P N，Soottawat B.Effect of ferulic acid on inhibition of polyphenoloxidase and quality changes of Pacific white shrimp（Litopenaeus vannamei）during iced storage［J］.Food Chemistry，2009，116：323－331.

［4］McEvily AJ，Iyengar R，Otwell S.Sulfite alternative prevents shrimp melanosis［J］.Food Technol，1991，45（9）：80－86.

［5］Montero P，Martínez－á lvarez O，Zamorano J P.Melanosis inhibition and 4－h(huán)exylresorcinol residual levels in deepwater pink shrimp（Parapenaeus longrostris）following various treatments［J］.Eur Food Res Technol，2006，223：16－21.

［6］Simpson B K，Marshall M R，Otwell W S.Phenoloxidase from shrimp（Penaues setiferus）：Purification and some properties［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1987，35：918－921.

［7］陳麗嬌，鄭明峰，李怡賓.南美白對蝦多酚氧化酶的生化特性［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2004，33：377－380.

［8］Aubourg S，Sotelo C，Gallardo J.Quality assessment of sardines during storage by measurement of fluorescent compounds［J］.Journal of Food Science，1997，62：295－299.

［9］中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)［S］.食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗－菌落總數(shù)測定GB4789.2－2008：1－4.

［10］SmallwoodA W，Ranieri T L，Satzger R D.Determination of 4－h(huán)exylresorcinolin crab meat［J］.JournalofAOAC International，1998，81（2）：488－491.

［11］凌關(guān)庭.4－己基間苯二酚（4HR）－一種能抑制褐變的新型抗氧護(hù)色劑［J］.食品工業(yè)，1997（3）：19－20.

［12］天津輕工業(yè)學(xué)院，無錫輕工大學(xué).食品生物化學(xué)［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1999：216－229.

［13］王正，陳敏，韓相晨.GB2741－1994海蝦衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［S］.中華人民共和國衛(wèi)生部，1994－08－01.

［14］徐麗敏，薛長湖，李兆杰，等.水溶性殼聚糖對南美白對蝦品質(zhì)及腐敗菌相變化的影響［J］.食品工業(yè)科技，2008，29（6）：107－110.

［15］Monsalve G A，Barbosa C G V，McEvily A J.Inhibition of enzymatic browning in apple products by 4－h(huán)exylresorcinol［J］. Food Technol，1995，49（41）：110－118.

Melanosis inhibition and residual levels of 4－h(huán)exylresorcinol combined with chitosan in pacific white shrimp（Litopenaeus vannamei）

LING Ping－h(huán)ua，LI Qing－chun，XIE Jing*
（College of Food Science&Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Melanosis inhibition of 0.002%4－HR with 1%chitosan（Group A），0.01%4－HR with 1%chitosan（Group B）and 0.05%4－HR with 1%chitosan（Group C）on pacific white shrimp were examined under cold store.The changes of sensory evaluation of melanosis（MSE），polyphenol oxidase（PPO），total bacterial coun（tTBC）and total volatile basic nitrogen（TVB－N）of shrimp were determined，the residual levels of 4－h(huán)exylresorcino（lRLOHR）were also detected.The results showed that the values of PPO and MSE of Group C were the lowest compared with the others throughout the storage process，but the RLOHR of Group C had exceeded 1mg/kg on the 4thday.The PPO and MSE of Group A and Group B were no significant difference（P＞0.05）on the 4thday，but the time of RLOHR of two groups exceeded 1mg/kg was the 8thand 6thday，respectively.According to TBC and TVB－N values，the shelf life of A，B and C were 6 days，6 days and 8 days，respectively.The shelf life of the controlled was only 4days.A certain concentration of 4－HR combined with chitosan not only can delay the melanosis safely and effectively，but also can extend the shelf－life.

4－h(huán)exylresorcinol；pacific white shrimp；melanosis；residual levels

TS254.4

A

1002－0306（2010）12－0309－04

2009－10－30 *通訊聯(lián)系人

凌萍華（1985－），男，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)品加工及貯藏工程方向研究。

上海市生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)科技領(lǐng)域重點科技項目（08391911500）；上 海 市 優(yōu) 秀 學(xué) 科 帶 頭 人 計 劃（09XD1402000）；上海市教育委員會重點學(xué)科建設(shè)項目資助（J50704）。