左 娟，馬美湖*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家蛋品加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖北 武漢 430070)

雞蛋涂膜保鮮劑中抑菌物質(zhì)的篩選

左 娟，馬美湖*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家蛋品加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖北 武漢 430070)

以大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella)為供試菌種，采用濾紙片法和二倍稀釋法測定6種植物精油的抑菌效果，6種植物精油對大腸桿菌和沙門氏菌的抑制結(jié)果均為：肉桂油＞冬青油＞紫蘇葉油＞茶樹油＞桉葉油＞連翹油。選定肉桂油、冬青油、紫蘇葉油3種植物精油配制復(fù)合抑菌物質(zhì)。復(fù)配抑菌物質(zhì)的配方為：肉桂油0.6mg/mL、冬青油0.4mg/mL、紫蘇葉油0.3mg/mL。

雞蛋保鮮；植物精油；復(fù)合抑菌物質(zhì)；抑菌效果

雞蛋的腐敗變質(zhì)是微生物、環(huán)境因素、和雞蛋本身的特性相互影響、相互作用的結(jié)果[1]，其中微生物是使雞蛋腐敗變質(zhì)的主要原因。雞蛋中含有豐富的水分、蛋白質(zhì)、脂肪、無機(jī)鹽和維生素，蛋白pH8.6～6.4，能夠滿足微生物生命活動的需要，是微生物理想的“天然培養(yǎng)基”[1]。鮮蛋在自然溫濕條件下，蛋內(nèi)各種酶的生物學(xué)活性較高，蛋外微生物活躍。雞蛋是一種高營養(yǎng)的食物，其產(chǎn)量大且具有季節(jié)性[2]，鮮蛋產(chǎn)后，若不進(jìn)行貯存保鮮處理，微生物會通過蛋孔侵入蛋內(nèi)，在蛋內(nèi)各種分解酶的作用，使蛋黃膜破裂[3-5]，蛋內(nèi)部分營養(yǎng)物質(zhì)被破壞分解，禽蛋的鮮度、衛(wèi)生狀況、營養(yǎng)價值下降[6]。因此如何減少微生物對雞蛋的污染及危害是雞蛋保鮮工作中的重要環(huán)節(jié)。

植物精油是從植物(花、芽、種子、樹葉、樹皮、草藥、木材、水果和根)中提取出來的[7]。近幾年許多研究發(fā)現(xiàn)，精油成分具有強(qiáng)烈的抑制或殺死微生物的特性[8-10]。本實驗采用植物精油作為雞蛋涂膜保鮮劑中的抑菌劑，因為單一的植物精油的抑菌譜是有限的，所以通過對單一的植物精油的抑菌實驗的基礎(chǔ)上篩選抑菌效果比較好的3種植物精油進(jìn)行復(fù)配成復(fù)合抑菌劑，以增廣抑菌譜。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桉葉油、紫蘇葉油、肉桂油、茶樹油、冬青油、連翹油 江西省吉安振興香料廠。

大腸桿菌(Escherichia coil)、沙門氏菌(Salmonella)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實驗室。

1.2 儀器與設(shè)備

YM 不銹鋼立式電熱蒸汽消毒器 上海三申醫(yī)療器械有限公司；DNP-90 82BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制備方法

1.3.1.1 培養(yǎng)基的制備

葡萄糖-酚紅肉湯培養(yǎng)基：每1000mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基加入1g酚紅，熔化，121℃滅菌30min。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：稱取營養(yǎng)瓊脂粉約4 5 g，加1000mL水，熔化，121℃滅菌30min。

1.3.1.2 菌懸液的制備

取少量已活化的待測菌于裝有9mL無菌水的試管中，充分混合，制成菌懸液，用無菌吸管取1mL 充分混合的菌懸液于試管中，加無菌水9mL，依次制成系列濃度的菌懸液。調(diào)至濃度為含孢子或菌體106～107個/mL的菌懸液，備用[11-14]。

1.3.2 實驗設(shè)計

1.3.2.1 比較單一植物精油抑菌效果的實驗設(shè)計

采用濾紙片法測定單一植物精油對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑；采用二倍稀釋法測定單一植物精油對大腸桿菌和沙門氏菌的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)。

1.3.2.2 復(fù)合抑菌物質(zhì)的正交試驗設(shè)計

單獨一種植物精油抗菌譜是有限的，需要把抑菌物質(zhì)進(jìn)行復(fù)配，從而來提高抗菌譜。從6種植物精油中挑選出3種抑菌效果比較好的植物精油，復(fù)配成復(fù)合抑菌物質(zhì)。肉桂油、冬青油、紫蘇葉油對大腸桿菌和沙門氏菌的正交試驗設(shè)計見表1。

1.3.3 測定項目

1.3.3.1 抑菌圈的測定

將直徑為6mm的圓濾紙片干熱滅菌，然后放入各植物精油中浸泡2h。取待試菌懸液0.3mL于相應(yīng)的瓊脂固體培養(yǎng)基中混合搖勻。待固體培養(yǎng)基凝固以后，用無菌鑷子將浸泡過植物精油的圓濾紙片貼在固體平板上，每皿貼3片，同時另取無菌濾紙作對照，每組做3個平皿平行實驗[13-15]。然后置37℃培養(yǎng)24h后測定圓濾紙片的抑菌圈直徑，結(jié)果取3次重復(fù)實驗的平均值。

1.3.3.2 最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測定

采用液體二倍稀釋法測定，取13×10cm滅菌試管8支，按1～8號依次編號。以無菌操作法，于每管中加入無菌葡萄糖-酚紅肉湯培養(yǎng)基2mL，然后在第1管中加入質(zhì)量濃度10mg/mL的植物精油2mL，充分混勻后，吸取2mL加入第2管中混勻，并按此法依次重復(fù)進(jìn)行遞增稀釋到第6管，第6管混勻后吸出2mL混合液棄去。以上1～6管中分別再加入培養(yǎng)好的稀釋菌液0.1mL。第7管中加入0.1mL稀釋菌液作陽性對照管，作為細(xì)菌對照，第8管中加試物(植物精油)2mL后混勻，吸出2mL混合液棄去，不加菌液作生長對照，作為純試物對照。每個組合對各種細(xì)菌的抑制實驗分別做3個平行樣[16-18]。將以上各試管置37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出觀察結(jié)果，以無細(xì)菌生長管所含最低試物質(zhì)量濃度作為MIC。

1.3.3.3 抑菌率的測定

分別取lmL復(fù)合抑菌物質(zhì)與0.lmL細(xì)菌懸液混合，充分搖勻。當(dāng)作用2h時，分別取0.3mL混合液，用混勻法傾注牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平皿。另取lmL無菌水與0.lmL菌液相混合后，也取0.3mL混合液，用混勻法傾注牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平皿，以作對照[17,19]。以上各皿均置37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌的生長數(shù)，計算抑菌率，見公式(1)。

1.3.3.4 復(fù)合抑菌物質(zhì)的最低殺菌質(zhì)量濃度(MBC)的測定

從測定1.3.3.2節(jié)無細(xì)菌生長的各試管中取樣，分別劃線接種于固體瓊脂平板培養(yǎng)基，在37℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后取出觀察結(jié)果。以固體瓊脂平板上菌落生長數(shù)少于5個的平板的最低含試物質(zhì)量濃度作為MBC[17,20-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種植物精油的抑菌圈直徑的測定結(jié)果

抑菌圈的判定標(biāo)準(zhǔn)是：抑菌圈直徑＞15mm時為最敏感、10～15mm為中度敏感，7～9mm時為低度敏感，無抑菌者為不敏感。6種植物精油對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑測定結(jié)果如表2所示。

由表2結(jié)果可見，肉桂油和冬青油對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑均大于15mm，屬于高度敏感；紫蘇葉油和茶樹油對大腸桿菌、沙門氏菌的抑菌圈均處于10～15mm之間，屬中度敏感；桉葉油和連翹油對大腸桿菌和沙門氏菌均處于7～9mm，屬于低度敏感。表明6種精油對大腸桿菌和沙門式菌均有抑制作用。綜合比較來看，對大腸桿菌的抑菌效果為肉桂油＞冬青油＞紫蘇葉油＞茶樹油＞桉葉油＞連翹油；對沙門氏菌的抑菌效果為肉桂油＞冬青油＞紫蘇葉油＞茶樹油＞桉葉油＞連翹油。

表 2 6種植物精油對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑Table 2 Bacteriostasis diameters of plant extraction oil on several test organisms

2.2 6種植物精油的MIC測定結(jié)果

采用二倍逐步稀釋法，測定6種植物精油的MIC，結(jié)果見表3、4。

表 3 6種植物精油對大腸桿菌的MIC的測定結(jié)果Table 3 MICs of six kinds of essential oil to Escherichia coli

表 4 6種植物精油對沙門氏菌的MIC測定結(jié)果Table 4 MICs of six kinds of essential oil to Salmonella

由表3、4可以看出，6種植物精油對大腸桿菌和沙門氏菌均有不同程度的抑制作用。肉桂油對大腸桿菌和沙門氏菌的MIC均為0.3125mg/mL；冬青油對大腸桿菌和沙門氏菌的MIC均為0.3125mg/mL；紫蘇葉油對大腸桿菌和沙門氏菌的MIC分別為0.625mg/mL和0.3125mg/mL；茶樹油對大腸桿菌和沙門氏菌的MIC均為0.625mg/mL；桉葉油對大腸桿菌和沙門氏菌的MIC均為0.625mg/mL；連翹油對大腸桿菌和沙門氏菌的MIC均為1.25mg/mL。

2.3 復(fù)合抑菌物質(zhì)的正交試驗結(jié)果

雞蛋很容易受微生物的感染，尤其容易受大腸桿菌和沙門氏菌的感染，沙門氏菌是致病菌，在雞蛋中不得檢出，所以綜合抑菌率中大腸桿菌占40%，沙門氏菌占60%，即：綜合抑菌率/%＝大腸桿菌抑菌率/%×0.4＋沙門氏菌抑菌率/%×0.6。

表 5 正交試驗結(jié)果Table 5 Results of orthogonal experiments

表 6 方差分析表Table 6 Variance analysis of orthogonal experiments

由表5的正交試驗結(jié)果可知，肉桂油、冬青油、紫蘇葉油對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌率影響的主次順序為：肉桂油＞冬青油＞紫蘇葉油。復(fù)合抑菌物質(zhì)的最佳配方應(yīng)為A3B2C1，即肉桂油0.6mg/mL，冬青油0.4mg/mL，紫蘇葉油0.3mg/mL。由表6的方差分析結(jié)果可以看出，肉桂油對大腸桿菌和沙門氏菌有顯著影響，冬青油和紫蘇葉油影響不顯著。

2.4 復(fù)合抑菌物質(zhì)的MIC測定結(jié)果

根據(jù)實驗設(shè)計，采用二倍稀釋法，測定復(fù)合抑菌物質(zhì)的MIC，結(jié)果見表7。

表 7 復(fù)合抑菌物質(zhì)的MIC測定結(jié)果Table 7 MICs of compound preservative

由表7可知，復(fù)合抑菌物質(zhì)對大腸桿菌的MIC為0.3125mg/mL，對沙門氏菌的MIC也為0.3125mg/mL。細(xì)菌對照組變色，純試物對照組不變色。

2.5 復(fù)合抑菌物質(zhì)的MBC測定結(jié)果

從表7中無細(xì)菌生長的各組取樣，分別劃線接種于固體瓊脂平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)觀察，以菌落數(shù)少于5個的平板，其取樣組質(zhì)量濃度為MBC，測定結(jié)果見表8。

表 8 復(fù)合抑菌物質(zhì)的MBC測定結(jié)果Table 8 MBCs of compound preservative

由表8可知，復(fù)合抑菌物質(zhì)對大腸桿菌的MBC為1.25mg/mL，對沙門氏菌的MBC為1.25mg/mL。

3 結(jié) 論

從以上實驗結(jié)果可以看出，植物精油有很強(qiáng)的抑菌效果，作為天然的抑菌物質(zhì)，植物精油在很多方面都有應(yīng)用。本實驗比較了桉葉油、紫蘇葉油、肉桂油、茶樹油、冬青油、連翹油的抑菌效果，通過濾紙片法和二倍稀釋法分別測定這6種植物精油對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈和MIC，結(jié)果均顯示肉桂油、冬青油、紫蘇葉油這3種植物精油的抑菌效果好于另外3種植物精油。因為單一的抑菌物質(zhì)的抑菌譜是有限的，而雞蛋中微生物除了大腸桿菌和沙門氏菌以外，還有很多種微生物，所以就需要配制復(fù)合的抑菌物質(zhì)。篩選出對大腸桿菌和沙門氏菌效果比較好的3種植物精油進(jìn)行復(fù)配來增大抑菌劑的抑菌譜，以上實驗配制出的復(fù)合抑菌物質(zhì)的配方為：肉桂油0.6mg/mL、冬青油0.4mg/mL、紫蘇葉油0.3mg/mL。復(fù)合抑菌物質(zhì)對大腸桿菌和沙門氏菌的MIC均為0.3125mg/mL，MBC均為1.25mg/mL。

[1] 馬美湖. 蛋與蛋制品加工學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2006: 67.

[2] JONES D R, THARRINGTON J B, CURTIS P A, et al. Effects of cryogenic cooling of shell eggs on egg quality[J]. Poult Sci, 2002, 81(5): 727-733.

[3] GAST R K, BEARD C W. Production of Salmonella enteritidiscontaminated eggs by experimentally infected hens[J]. Avian Dis, 1990,34(2): 438-446.

[4] HUMPHREY T J, WHITEHEAD A, GAWLER A H, et al. Numbers of Salmonella enteritidis in the contents of naturally contaminatedeggs[J]. Epidemiol Infect, 1994, 106(3): 489-496.

[5] KIRUNDA D F K, MCKEE S R. Relating quality characteristics of aged eggs and fresh eggs to vitelline membrane strength as determined by a texture analyzer[J]. Poult Sci, 2000,79(8): 1189-1193.

[6] 閻錫海, 王延鋒, 李延清. 我國禽蛋貯存保鮮技術(shù)存在的問題及其解決途徑[J]. 中國家禽, 2002, 24(22): 41-43.

[7] van de BRAAK S A A J, LEIJTEN G C J J. Essential oils and oleoresins:a survey in the Netherlands and other major markets in the European Union[C]. CBI, Centre for the Promotion of Imports from Developing Countries, Rotterdam, 1999: 116.

[8] FRIENDMAN M, PHILIP R H, ROBERT E M. Bactericidal activities of plant essential oils and some of their isolated constituents against Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Listeria monocytogenes,and Salmonella enterica[J]. Journal of Food Protection,2002, 65(10): 1545-1560.

[9] KURITA N. Antifungal activity and molecular orbital energies of aldehyde compounds from oils of higher plants[J]. Agric Bivl Chem, 1979,43(11): 2365-2371.

[10] WILSON C L, SOLAR J M, EL G A, et al. Rapid evaluation of plant extracts and essential oils for antifungal activity against Botrytis cinerea[J]. Plant Disease, 1997, 81(2): 204-210.

[11] 唐裕芳, 張妙玲, 葉進(jìn)富. 艾葉超臨界CO2萃取物的抑菌活性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2006, 18(2): 269-272.

[12] 陸占國, 郭紅轉(zhuǎn), 封丹. 超聲波法提取香菜莖葉精油和成分解析以及抗菌作用[J]. 中國調(diào)味品, 2007(2): 42-46.

[13] 沈萍, 范秀容, 李廣武. 微生物學(xué)實驗[M]. 北京: 高等教育出版社,1999: 90-95.

[14] 劉玉民, 劉亞敏, 李鵬霞. 楓香葉精油抑菌活性及抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(11): 134-137.

[15] 陳奇, 張根生, 邢楠楠, 等. 八角茴香精油的抗菌活性及在肉類保鮮中的應(yīng)用研究[J]. 中國調(diào)味品, 2007(4): 49-51.

[16] 馬美湖. 茶多酚復(fù)合劑對實驗動物抗性效果與機(jī)理研究[D]. 長沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005: 29-30

[17] 顧仁勇, 傅偉昌, 銀永忠. 丁香和肉桂精油聯(lián)合抗菌作用初步研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(10): 115-117.

[18] 吳慧清, 吳清平, 石立三, 等. 植物精油對微生物的抑菌效果評估研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(12): 83-86.

[19] 關(guān)文強(qiáng), 李淑芬. 丁香精油對果蔬采后病原菌抑制效應(yīng)研究[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(12): 227-230.

[20] 吳楠, 祖元剛, 王微. 大蒜精油抗菌活性研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(3): 103-105.

[21] 張娜, 關(guān)文強(qiáng), 李春媛. 芥末精油對果蔬采后病原菌抑制效果的研究[J]. 保鮮與加工, 2008(3): 39-41.

Screening of Bacteriostatic Materials in Egg-coating Preservative

ZUO Juan，MA Mei-hu*
(National Subsidiary Research Center of Egg Processing, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Spoilage of fresh egg is mainly caused by microorganisms. The screening of egg-coating preservatives was evaluated through antibacterial effect. Escherichia coli and Salmonella were used as test strains to determine bacteriostatic effect on essential oil through filter paper or double dilution methods. Six kinds of plant volatile oil exhibited the inhibition effect on Escherichia coli and Salmonella according to the following order from strong to weak, cinnamon oil, ilex oil, perilla leaf oil, tea tree oil, eucalyptus oil and forsythia oil. Moreover, cinnamon oil, ilex oil and perilla leaf oil have been selected from six kinds of essential oil as the compound bacteriostatic material. The compound bacteriostatic formula was 0.6 mg/mL cinnamon oil, 0.4 mg/mL ilex oil and 0.3 mg/mL perilla leaf oil.

egg preservation；plant volatile oil；compound bacteriostatic material；bacteriostatic effect

TS209

A

1002-6630(2010)09-0019-04

2009-08-01

國家“948”項目(2006-G36)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項

左娟(1984—)，女，碩士研究生，主要從事禽蛋研究。E-mail：zuojuan19840110@126.com

馬美湖(1957—)，男，教授，博士，主要從事畜產(chǎn)品研究。E-mail：mameihuhn@yahoo.com.cn