付 鴻，甄曉榮，陳 瑛，劉建鋒，趙曉虹

（甘肅省疾病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730000）

甘肅省風(fēng)疹病毒基因型分析

付 鴻，甄曉榮，陳 瑛，劉建鋒，趙曉虹

（甘肅省疾病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730000）

目的了解甘肅省2009年風(fēng)疹病毒的分子生物學(xué)特征，確定其基因型別。方法用Vero/Slam細(xì)胞從風(fēng)疹暴發(fā)和散發(fā)患者的標(biāo)本中分離風(fēng)疹病毒，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和序列測(cè)定與分析鑒定其基因型。結(jié)果甘肅省首次分離出的3株風(fēng)疹病毒鑒定為1E基因型。與2株世界衛(wèi)生組織1E基因型的參考株（T14-CH-02株、M1-MAL-01株）形成了一個(gè)分支，均屬于1E基因型，核苷酸同源性為99%～100%。結(jié)論此次疫情是由1E基因型風(fēng)疹病毒引起的暴發(fā)疫情，此項(xiàng)研究為以后甘肅省風(fēng)疹病毒的分子流行病學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

風(fēng)疹病毒；序列分析；基因型

風(fēng)疹是由風(fēng)疹病毒引起的急性呼吸道傳染病，風(fēng)疹病毒屬于披膜病毒屬，單鏈，正鏈RNA，只有一個(gè)血清型，人是其自然宿主。妊娠期婦女感染風(fēng)疹病毒后，易引起嬰兒先天性風(fēng)疹綜合征（CRS）。在托幼機(jī)構(gòu)和中、小學(xué)校也常有風(fēng)疹流行或暴發(fā)，危害青少年健康。目前，我國(guó)對(duì)風(fēng)疹病毒的流行病學(xué)研究多集中在血清流行病學(xué)上，而對(duì)分子流行病學(xué)的研究相對(duì)較少。為做好發(fā)熱出疹性疾病的病原學(xué)診斷，了解2009年甘肅省風(fēng)疹暴發(fā)或散發(fā)疫情的風(fēng)疹病毒分子生物學(xué)特征，現(xiàn)將分離到的風(fēng)疹病毒進(jìn)行基因型分析。

1 材料和方法

1.1 資料與標(biāo)本來(lái)源

資料來(lái)源于暴發(fā)和散發(fā)病例5個(gè)縣區(qū)甘肅省疾病預(yù)防控制中心（CDC）個(gè)案調(diào)查表及標(biāo)本送檢表，血清、咽拭子標(biāo)本來(lái)自5個(gè)風(fēng)疹暴發(fā)和散發(fā)的縣區(qū)的22份標(biāo)本。咽拭子標(biāo)本冷藏送省CDC麻疹實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒分離，分離血清進(jìn)行風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體檢測(cè)，22例患者的基本信息見表1。

1.2 麻疹、風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體檢測(cè)

用捕獲法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)患者血清中的麻疹和風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體。檢測(cè)采用廣東省珠海市海泰生物制藥公司生產(chǎn)的試劑盒，具體操作見試劑盒說(shuō)明書。

1.3 風(fēng)疹病毒分離方法

將處理后的標(biāo)本液接種到長(zhǎng)成單層的Vero/Slam細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞/淋巴信號(hào)激活因子轉(zhuǎn)染的非洲綠猴腎細(xì)胞）上，35℃吸附1h加維持液。隨后在35℃培養(yǎng)，同時(shí)做好陰性細(xì)胞對(duì)照，盲傳3代后送國(guó)家麻疹實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行風(fēng)疹病毒鑒定[1]。

1.4 風(fēng)疹病毒株的鑒定

將盲傳3代的14株可疑風(fēng)疹病毒再鑒定，序列測(cè)定和基因定型在國(guó)家麻疹實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。國(guó)家麻疹實(shí)驗(yàn)室提取風(fēng)疹病毒的RNA，用特異的PCR引物擴(kuò)增EI基因，對(duì)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物的核苷酸片段進(jìn)行序列測(cè)定和分析。

表1 22例患者基本信息

1.5 序列分析

調(diào)出世界衛(wèi)生組織（WHO）參考株E1基因739個(gè)核苷酸序列，分別使用BioEdit7.0和MEGA3.0生物學(xué)軟件對(duì)甘肅省分離到的3株毒株和參考株進(jìn)行基因親緣性關(guān)系分析和核苷酸變異分析。

2 結(jié)果

2.1 麻疹、風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體檢測(cè)結(jié)果

對(duì)采集的22份患者血清標(biāo)本進(jìn)行麻疹和風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體檢測(cè)。麻疹I(lǐng)gM抗體陰性；風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體10份陽(yáng)性，可疑1份，11份陰性，但與實(shí)驗(yàn)室確診的風(fēng)疹病例有流行病學(xué)聯(lián)系。

2.2 病毒分離結(jié)果

咽拭子標(biāo)本，在Vero/Slam細(xì)胞上盲傳3代后未見典型的細(xì)胞病變，收獲、凍存于-70℃冰箱備用。

2.3 基因型鑒定結(jié)果

14株風(fēng)疹病毒經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，有3株鑒定為陽(yáng)性標(biāo)本。通過(guò)擴(kuò)增風(fēng)疹病毒E1基因的739個(gè)核苷酸片段和序列測(cè)定，分析證實(shí)為1E基因型（見表2）。

表2 3株風(fēng)疹病毒鑒定結(jié)果及命名

2.4 基因親緣關(guān)系和核苷酸變異分析

利用BioEdit7.0和MEGA3.0生物學(xué)軟件對(duì)甘肅省2009年分離的3株風(fēng)疹病毒與WHO RV 13個(gè)基因型的32株參考株相對(duì)應(yīng)的核酸片段構(gòu)建基因親緣關(guān)系樹（見圖1）。此次在我省鑒定出的3株風(fēng)疹病毒基因型與2株WHO 1E基因型的參考株（T14-CH-02株、M1-MAL-01株）形成了一個(gè)分支，均屬于1E基因型，核苷酸同源性為99%～100%。

3 討論

WHO建議將風(fēng)疹和CRS的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)納入麻疹實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)中，病毒分離主要用于開展分子流行病學(xué)研究，鑒定病毒基因型，識(shí)別病毒來(lái)源和確定傳播途徑。

我國(guó)尚未全面開展系統(tǒng)的風(fēng)疹和CRS的監(jiān)測(cè)，但我省麻疹實(shí)驗(yàn)室已于2004年開始將風(fēng)疹的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)整合到麻疹監(jiān)測(cè)中去，基于ELISA的風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體檢測(cè)已基本成熟，2009年我省首次開展了風(fēng)疹病毒的實(shí)驗(yàn)室分離工作。

圖1 甘肅省3株風(fēng)疹病毒株與WHO基因型構(gòu)建的基因親緣關(guān)系樹

隨著分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)手段的不斷發(fā)展與完善，我國(guó)已初步建立了風(fēng)疹病毒毒株庫(kù)和基因數(shù)據(jù)庫(kù)。風(fēng)疹病毒有3個(gè)重要的結(jié)構(gòu)蛋白，分別為位于包膜上的E1和E2兩種糖蛋白，和位于殼體上的非糖化蛋白C[2，3]。E1與風(fēng)疹的血凝血融有關(guān)，又具有中和抗原作用，其基因全長(zhǎng)1484bp，編碼風(fēng)疹大部分位于抗原表位，WHO將E1基因其中的739個(gè)核苷酸片段作為分子流行病學(xué)研究的序列[4，5]。根據(jù)我國(guó)1999～2002年對(duì)風(fēng)疹病毒進(jìn)行的分子流行病學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)至少有4個(gè)基因型（1E、1F、2A、2B）曾在中國(guó)流行[6]。但近5年的研究表明[7]，1E基因型已取代其他基因型，逐漸成為RV優(yōu)勢(shì)流行基因型。

此次分離出的1E基因型是我省渭源縣風(fēng)疹暴發(fā)疫情，也是由1E基因型風(fēng)疹病毒引起，這與我國(guó)近年來(lái)主要流行的風(fēng)疹病毒基因型相符，未發(fā)生顯著變異。此外，將我省此次鑒定出的風(fēng)疹病毒基因型與近幾年相鄰省份（四川、寧夏、青海）[7，8]鑒定出的風(fēng)疹流行病毒基因型比較，未發(fā)現(xiàn)明顯的時(shí)間與地理分布傾向。

我國(guó)在風(fēng)疹的病毒學(xué)檢測(cè)方面還比較薄弱，而我省的檢測(cè)工作屬于起步階段，此次研究為甘肅省風(fēng)疹病毒的分子流行病學(xué)研究奠定了良好基礎(chǔ)，為今后風(fēng)疹病毒檢測(cè)，建立甘肅省風(fēng)疹病毒毒株庫(kù)和基因數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定甘肅省風(fēng)疹病毒的傳播源和傳播鏈提供了科學(xué)依據(jù)。

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