李鑫，劉軍，趙沁沁，徐愛(ài)才

武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023

共表達(dá)SHMT和TPase載體的構(gòu)建及雙酶法合成L-色氨酸

李鑫，劉軍，趙沁沁，徐愛(ài)才

武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023

利用重組大腸桿菌表達(dá)絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)和色氨酸酶(TPase)，并利用雙酶法合成 L-色氨酸。采用 PCR從大腸桿菌 K12基因組中擴(kuò)增上述兩種酶的基因，利用 pET-28a載體，構(gòu)建單表達(dá)重組質(zhì)粒 pET-SHMT、pET-TPase和共表達(dá)重組質(zhì)粒pET-ST。將上述3種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明，單表達(dá)基因工程菌BL21(DE3)/pET-SHMT和BL21(DE3)/pET-TPase分別在47 kDa(SHMT)和50 kDa(TPase)處有蛋白表達(dá)帶；共表達(dá)基因工程菌BL21(DE3)/pET-ST在上述兩處均有蛋白表達(dá)帶。與宿主菌相比，單表達(dá)SHMT基因工程菌產(chǎn)酶活性提高了6.4倍；單表達(dá)TPase基因工程菌產(chǎn)酶活性提高了8.4倍；共表達(dá)SHMT和TPase基因工程菌產(chǎn)酶活性分別提高了6.1和6.9倍。利用工程菌所產(chǎn)酶進(jìn)行雙菌雙酶法和單菌雙酶法合成L-色氨酸。兩菌雙酶合成L-色氨酸的累積量達(dá)到41.5 g/L，甘氨酸轉(zhuǎn)化率為83.3%，吲哚轉(zhuǎn)化率為92.5%；單菌雙酶合成L-色氨酸的累積量達(dá)到28.9 g/L，甘氨酸轉(zhuǎn)化率為82.7%，吲哚轉(zhuǎn)化率為82.9%。

絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶，色氨酸酶，串聯(lián)表達(dá)，雙酶法合成

Abstract:Hydroxymethyltransferase(SHMT)and tryptophanase(TPase)are key enzymes in biosynthesis of L-tryptophan.We constructed three recombinant plasmids, including pET-SHMT, pET-TPase, and pET-ST for over-expression or co-expression of SHMT and TPase inEscherichia coliBL21(DE3).The SDS-PAGE analysis showed that the recombinant proteins of 47 kDa and 50 kDa were expressed of pET-SHMT and pET-TPase, respectively.As compared to the host stain, the enzyme activity of SHMT and TPase was increased by 6.4 and 8.4 folds, respectively.Co-expression of both recombinant proteins, 47 kDa and 50 kDa, was also successful by using pET-ST and the enzyme activities were enhanced by 6.1 and 6.9 folds.We designed two pathways of dual-enzymatic synthesis of L-tryptophan by using these recombinant strains as source of SHMT and TPase.In the first pathway, the pET-SHMT carrying strain was used to catalyze synthesis of L-serine, which was further transformed into L-tryptophan by the pET-TPase expressing strain.These two steps sequentially took place in different bioreactors.In the second pathway, the pET-STcarrying strain, in which two enzymes were co-expressed, was used to catalyze simultaneously two steps in a single bioreactor.HPLC analysis indicated a high yield of 41.5 g/L of L-tryptophan was achieved in the first pathway, while a lower yield of 28.9 g/L was observed in the second pathway.In the first pathway, the calculated conversion rates for L-glycine and indole were 83.3% and 92.5%, respectively.In the second pathway, a comparable conversion rate, 82.7%, was achieved for L-glycine, while conversion of indole was much lower, only 82.9%.

Keywords:hydroxymethyltransferase, tryptophanase, co-expression, dual-enzymatic synthesis

L-色氨酸是人和動(dòng)物重要的必需氨基酸，在醫(yī)藥、食品和飼料添加劑等方面具有廣泛的用途。它是我國(guó)目前尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的少數(shù)幾種氨基酸之一，每年需要大量進(jìn)口。L-色氨酸生產(chǎn)方法有提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和酶促轉(zhuǎn)化法。其中，前 3種方法存在材料來(lái)源有限、需多步合成工藝和光學(xué)拆分以及得率低、周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，而酶促轉(zhuǎn)化法具有終產(chǎn)物積累量高、反應(yīng)周期短、分離提純?nèi)菀椎葍?yōu)點(diǎn)，是廉價(jià)生產(chǎn)L-色氨酸有效的方法[1-2]。以L-絲氨酸和吲哚為原料的酶法途徑，是酶法生產(chǎn)L-色氨酸的一條重要途徑[3]，其主要缺陷是 L-絲氨酸價(jià)格貴，與L-色氨酸價(jià)格幾乎相當(dāng)。若能以廉價(jià)的原料生產(chǎn)絲氨酸，再以所得到的絲氨酸為原料生產(chǎn) L-色氨酸，則可望實(shí)現(xiàn) L-色氨酸的廉價(jià)生產(chǎn)。Hatakeyama等[4]報(bào)道了兩步酶法合成L-色氨酸：以價(jià)廉的甘氨酸和甲醛為原料，在絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將甘氨酸和甲醛轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-絲氨酸；再在色氨酸酶的作用下，添加吲哚，則L-絲氨酸可轉(zhuǎn)變?yōu)?L-色氨酸。在國(guó)內(nèi)，韋平和等[5]也提出了兩步酶法合成L-色氨酸。但Hatakeyama等所用的酶來(lái)自兩種微生物細(xì)胞，增加了生產(chǎn)工藝的復(fù)雜性和成本。迄今未見(jiàn)單一細(xì)胞同時(shí)生產(chǎn)絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶和色氨酸酶，并用于酶法生產(chǎn)L-色氨酸的報(bào)道。

本研究構(gòu)建單表達(dá)SHMT基因工程菌、單表達(dá)TPase基因工程菌、共表達(dá)SHMT和TPase基因工程菌。利用構(gòu)建的3種基因工程菌株，進(jìn)行兩菌兩次發(fā)酵產(chǎn)酶和單菌一次發(fā)酵產(chǎn)酶。采用雙菌雙酶法和單菌雙酶法兩種途徑完成酶法合成L-色氨酸，對(duì)兩種酶法合成途徑進(jìn)行比較，以期達(dá)到簡(jiǎn)化產(chǎn)酶菌的發(fā)酵和酶促轉(zhuǎn)化工藝，降低L-色氨酸生產(chǎn)成本，為實(shí)現(xiàn)L-色氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

pET-28a表達(dá)載體、大腸桿菌 K12、大腸桿菌BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 生化試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶及PyrobestTMDNA聚合酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒及瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；丙烯酰胺(Acr)及甲叉雙丙烯酰胺(Bis)購(gòu)自 Fluka公司；四甲基乙二胺(TEMED)及磷酸吡哆醛(PLP)購(gòu)自Sigma公司；四氫葉酸為本實(shí)驗(yàn)室自制(硼氫化鈉還原法[6])；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

高效液相色譜儀(安捷倫 1200 HPLC)；泵(安捷倫 1100/1200四元泵)；檢測(cè)器(安捷倫1200可變波長(zhǎng)檢測(cè)器)。

1.2 方法

1.2.1 基因的PCR擴(kuò)增

PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

PCR 反應(yīng)體系(50 μL)：無(wú)菌三蒸水 40 μL，10×Buffer 5 μL，上、下游引物各 1 μL，模板 1 μL，dNTPs 1 μL，PyrobestDNA 聚合酶 1 μL。兩基因 PCR 反應(yīng)條件均為：94℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min ，53℃1 min，72 ℃ 2 min ，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增到的編碼SHMT和TPase的基因分別連接到 pET-28a載體上，構(gòu)建單表達(dá)重組質(zhì)粒pET-SHMT和pET-Tpase，再利用以上兩個(gè)重組質(zhì)粒構(gòu)建共表達(dá)重組質(zhì)粒pET-ST。PCR產(chǎn)物純化和凝膠回收按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，基因的酶切和連接按所用酶的商品說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.3 重組工程菌的誘導(dǎo)及酶活測(cè)定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(DE3)，構(gòu)建基因工程菌。利用重組菌進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶(方法參照pET操作手冊(cè))，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析蛋白表達(dá)情況[7]，并對(duì)重組工程菌所產(chǎn)酶進(jìn)行酶活測(cè)定(SHMT和 TPase酶活測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[8]和[9])。

1.2.4 雙菌雙酶法合成L-色氨酸

酶促反應(yīng)以0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 8.0)作為溶劑，反應(yīng)在500 mL四頸燒瓶中進(jìn)行，反應(yīng)液體積為350 mL，其中加入30 g經(jīng)0.1%(W/V)十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)裂解液處理過(guò)的產(chǎn)SHMT的菌體，30 g甘氨酸，10 mg PLP，0.5 g四氫葉酸，同時(shí)向反應(yīng)液中加入適量巰基乙醇，并通氮?dú)庖悦廨o酶四氫葉酸被氧化[10-11]。反應(yīng)溫度37℃，初始pH為7.5，攪拌速度60 r/min。另一底物甲醛初始加入的濃度控制在20 mmol/L以下，此后以流加的方式加入甲醛，維持反應(yīng)液pH控制在 6.8～7.2。當(dāng)反應(yīng)液pH不變化時(shí)，反應(yīng)達(dá)到平衡，停止反應(yīng)。離心棄菌體，將上述反應(yīng)液裝入另一反應(yīng)罐，并向其中加入30 g經(jīng)同樣方法破碎處理的產(chǎn)TPase的菌體，9 g吲哚，5 mg PLP，200 μL TritonX-100，反應(yīng)pH調(diào)節(jié)到8.8，反應(yīng)溫度37℃，攪拌速度60 r/min[5]。反應(yīng)進(jìn)行時(shí)每隔 6 h檢測(cè)一次反應(yīng)液中吲哚濃度(采用對(duì)二甲氨基苯甲醛作為顯色劑，進(jìn)行光度定量測(cè)定[12])，當(dāng)吲哚濃度不再變化時(shí)停止反應(yīng)。

1.2.5 單菌雙酶法合成L-色氨酸

參考雙菌雙酶法反應(yīng)條件，將經(jīng)破碎處理的產(chǎn)雙酶的菌體、甘氨酸、吲哚、PLP等原料一次性加入同一反應(yīng)罐。為使主要反應(yīng)底物甘氨酸和吲哚能被充分利用，并得到一定累積量的L-色氨酸，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 3組甘氨酸和吲哚加入量，分別為甘氨酸+吲哚：① 20 g+5 g；② 25 g+7 g；③ 30 g+9 g，輔酶等其余原料的量同比例增減。反應(yīng)體積仍為350 mL。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中通氮?dú)?，反?yīng)溫度 37℃，初始 pH為7.5，攪拌速度60 r/min，同樣以流加的方式加入甲醛維持反應(yīng)液 pH控制在 6.8～7.2。當(dāng)反應(yīng)液 pH不再變化以后，每隔2 h檢測(cè)反應(yīng)液中吲哚濃度。當(dāng)反應(yīng)液中吲哚濃度不再變化時(shí)，終止反應(yīng)。

1.2.6 高效液相測(cè)定L-色氨酸含量

采用安捷倫1200系列安捷倫 C-18反相硅膠柱(5 μm；4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：甲醇∶1%冰乙酸= 10∶90；柱流量：1 mL/min；柱溫：30℃；可變波長(zhǎng)掃描紫外檢測(cè)器(VWD)，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm[3]。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET-SHMT和pET-TPase的構(gòu)建

提取大腸桿菌K12基因組，PCR分別擴(kuò)增編碼SHMT的基因和TPase的基因，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增編碼SHMT和TPase的基因Fig.1 Amplification of gene coding SHMT and gene coding TPase by PCR.M: DNA marker DL2000; 1: PCR product of gene coding SHMT; 2: PCR product of gene coding TPase.

擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)計(jì)大小相符。回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)NcoI和BamH I雙酶切，分別連接到經(jīng)同樣雙酶切的 pET-28a上，構(gòu)建兩個(gè)重組質(zhì)粒 pET-SHMT和pET-TPase，重組質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖2。用BglII/Hind III雙酶切鑒定兩個(gè)重組質(zhì)粒，酶切結(jié)果見(jiàn)圖3。酶切產(chǎn)生兩條帶，分子量大的與經(jīng)酶切后的pET-28a條帶大小一致；分子量小的為含有T7啟動(dòng)子和相應(yīng)基因的DNA片段，較各自基因的PCR產(chǎn)物分子量大。經(jīng)酶切鑒定的重組質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與報(bào)道的序列(GenBank Accession No.NC_000913)一致。

2.2 SHMT和TPase共表達(dá)重組質(zhì)粒pET-ST的構(gòu)建

將已構(gòu)建的質(zhì)粒pET-TPase經(jīng)BglII和Hind III雙酶切，并回收含T7啟動(dòng)子和TPase基因的DNA片段。用BamH I和Hind III雙酶切質(zhì)粒pET-SHMT，回收酶切質(zhì)粒，并與含 T7啟動(dòng)子和 TPase基因的DNA片段相連，構(gòu)建共表達(dá)重組質(zhì)粒 pET-ST，共表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖2。

圖2 pET-SHMT、pET-TPase和 pET-ST重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.2 Construction of recombinant plasmids pET-SHMT,pET-TPase and pET-ST.

共表達(dá)質(zhì)粒上SHMT和TPase的表達(dá)由各自的T7啟動(dòng)子控制。用BglII和Hind III雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pET-ST，雙酶切結(jié)果見(jiàn)圖3，酶切產(chǎn)生的兩條帶，分子量大的條帶對(duì)應(yīng)經(jīng)酶切后的 pET-28a片段；小片段的大小相當(dāng)于含T7啟動(dòng)子的SHMT片段和含T7啟動(dòng)子的TPase片段之和，表明共表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 酶切鑒定 3個(gè)重組質(zhì)粒 pET-SHMT、pET-TPase和pET-STFig.3 Identification of pET-SHMT, pET-TPase and pET-ST recombinant plasmids.M: DNA marker DL2000; 1: digestion of plasmid pET-28a byBglII/Hind III; 2: digestion of plasmid pET-SHMT byBglII/Hind III; 3: digestion of plasmid pET-TPase byBglII/Hind III; 4: digestion of plasmid pET-ST byBglII/Hind III.

2.3 重組基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活測(cè)定

挑取帶有空載體的宿主菌 BL21(DE3)/pET-28a及 3種基因工程菌 BL21(DE3)/pET-SHMT、BL21(DE3)/pET-TPase和BL21(DE3)/pET-ST，分別接種到裝有20 mL LB的100 mL三角瓶中，培養(yǎng)基中加入50 μg/mL卡那霉素(Kan)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。按1%接種量接入裝有50 mL LB的250 mL三角瓶中，37℃培養(yǎng)到OD600至 0.8～1.0，加入 IPTG 至終濃度為1 mmol/L。誘導(dǎo)6 h后，測(cè)定3種重組菌所產(chǎn)酶的活力。

將誘導(dǎo)6 h的2 mL細(xì)菌培養(yǎng)液離心獲菌體，水洗滌一次后加入1 mL CTAB裂解緩沖液(含0.1%CTAB、0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 8.0))懸浮菌體，37℃溫浴30 min，離心取上清，將上清樣品和誘導(dǎo)6 h的全菌樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳對(duì)比分析，結(jié)果見(jiàn)圖4所示。

從全菌電泳結(jié)果可見(jiàn)，誘導(dǎo) 6 h后，單表達(dá)基因工程菌BL21(DE3)/pET-SHMT和BL21(DE3)/pETTPase分別在分子量 47 kDa(SHMT)和 50 kDa(TPase)處有蛋白表達(dá)帶；共表達(dá)基因工程菌BL21(DE3)/pET-ST在上述兩處位置均有蛋白表達(dá)帶。上清樣品的電泳結(jié)果表明，3種基因工程菌誘導(dǎo)表達(dá)的可溶性目的蛋白量占各自上清液中蛋白總量的50%以上，相比全菌中誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白的量則較少，表明誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白大多以包涵體形式存在。共表達(dá)基因工程菌中可溶性SHMT和TPase的蛋白量略低于單表達(dá)SHMT和單表達(dá)TPase的可溶性蛋白量。

圖4 SDS-PAGE電泳分析目的蛋白在重組菌中的表達(dá)及其可溶性Fig.4 SDS-PAGE analysis of protein expression and solubility in recombinant strains.M: protein molecular weight markers(20.1, 29.0, 44.3, 66.4, 97.2 kDa); 1: BL21(DE3)/pET-ST; 2: BL21(DE3)/pET-TPase; 3: BL21(DE3)/pET-SHMT;4: BL21(DE3)/pET-28a; 5: soluble proteins of SHMT and TPase in BL21(DE3)/pET-ST; 6: soluble proteins of TPase in BL21(DE3)/pET-TPase; 7: soluble proteins of SHMT in BL21(DE3)/pET-SHMT.

對(duì)帶有空載體的宿主菌和3種基因工程菌進(jìn)行酶活力測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖5。攜帶空載體的宿主菌BL21(DE3)/pET-28a，兩種單表達(dá)基因工程菌BL21(DE3)/pET-SHMT，BL21(DE3)/pET-Tpase和共表達(dá)基因工程菌BL21(DE3)/pET-ST的SHMT酶活(U/mL)分別為 34.3、220.7、35.1、210.2；Tpase 酶活(U/mL)分別為13.5、12.8、113.7、93.5。相比攜帶空載體的宿主菌，兩種單表達(dá)基因工程菌 SHMT和TPase酶活分別提高了6.4倍和8.4倍；共表達(dá)基因工程菌的SHMT酶活和TPase酶活分別提高了6.1倍和6.9倍。

圖5 對(duì)照菌株、單表達(dá)及共表達(dá)基因工程菌株SHMT、TPase酶活比較Fig.5 Activity of the enzymes SHMT, TPase in different strains.1: BL21(DE3)/pET-28a; 2: BL21(DE3)/pET-SHMT; 3:BL21(DE3)/pET-TPase; 4: BL21(DE3)/pET-ST.

2.4 雙菌雙酶法合成L-色氨酸

轉(zhuǎn)化反應(yīng)分為兩步在兩個(gè)反應(yīng)罐中進(jìn)行，第 1步反應(yīng)合成L-絲氨酸，反應(yīng)進(jìn)行45 h達(dá)到平衡，消耗甲醛溶液(甲醛含量40%)約25 mL(25.4 g)。甲醛溶液以流加的方式加入，設(shè)定pH高于7.2開始流加甲醛，pH低于6.8停止流加。加入甲醛后，反應(yīng)液pH降低，甲醛逐漸消耗后，反應(yīng)液pH緩慢回升。當(dāng)反應(yīng)液pH持續(xù)在6.8左右不再回升，則反應(yīng)達(dá)到平衡。以此方式加入甲醛，其殘留量很低，消耗的甲醛全部用于合成L-絲氨酸，以此計(jì)算甘氨酸的轉(zhuǎn)化率為83.3%。第2步，將L-絲氨酸合成反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到另一反應(yīng)罐中，加入吲哚，在 TPase催化下合成 L-色氨酸，反應(yīng)進(jìn)行 48 h，高效液相測(cè)定 L-色氨酸的累積量為41.5 g/L。計(jì)算得到吲哚轉(zhuǎn)化率為92.5%。

2.5 單菌雙酶法合成L-色氨酸

利用共表達(dá)基因工程菌產(chǎn)兩種酶，使兩步合成反應(yīng)在同一反應(yīng)罐中同時(shí)進(jìn)行。3組實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 原料甘氨酸和吲哚在不同投料量下單菌雙酶法合成L-色氨酸Table 2 Dual-enzymatic synthesis of L-tryptophan at different quantities of two substrates of glycine and indole

第1組實(shí)驗(yàn)甘氨酸和吲哚加入量少，等體積條件下底物濃度相對(duì)較低，在加入相同菌體量的條件下，兩種底物的轉(zhuǎn)化率高，但L-色氨酸的累積量低于其他兩組。第2組和第3組實(shí)驗(yàn)在反應(yīng)時(shí)間、甲醛消耗量和L-色氨酸的累積量上相差甚少，但兩種底物的轉(zhuǎn)化率相差大，推測(cè)第3組實(shí)驗(yàn)的底物加入過(guò)量，加入原料未被酶充分利用。第 2組實(shí)驗(yàn)的原料轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物累積量均較高，其最終的L-色氨酸的累積量為28.9 g/L，故該組實(shí)驗(yàn)的原料加入量為最適。相比雙菌雙酶法，單菌雙酶法在反應(yīng)時(shí)間上縮短45 h，成本更節(jié)省，但L-色氨酸的累積量略低。

3 討論

以L-絲氨酸和吲哚為原料合成L-色氨酸的途徑是酶法生產(chǎn)L-色氨酸的重要途徑，該途徑主要缺陷是L-絲氨酸價(jià)格貴，與L-色氨酸價(jià)格幾乎相當(dāng)。SHMT可利用廉價(jià)的甘氨酸和甲醛合成L-絲氨酸，克服了這一缺陷。催化這一酶促反應(yīng)的除了色氨酸酶，還有色氨酸合成酶。盡管色氨酸合成酶動(dòng)力學(xué)特征明顯優(yōu)于色氨酸酶，但原料之一的吲哚對(duì)其有強(qiáng)烈的抑制作用，而色氨酸酶對(duì)吲哚具有良好的穩(wěn)定性。因此，本研究選擇SHMT和TPase兩種酶，構(gòu)建單表達(dá)SHMT基因工程菌、單表達(dá)TPase基因工程菌和共表達(dá)SHMT和TPase基因工程菌。一般認(rèn)為，多基因在質(zhì)粒上共表達(dá)比單獨(dú)表達(dá)時(shí)活性會(huì)降低。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，串聯(lián)在前的SHMT與單獨(dú)表達(dá)時(shí)相比酶活基本持平；串聯(lián)在后的 TPase盡管酶活不如單表達(dá)高，但與宿主菌相比提高6.9倍。單表達(dá)的表達(dá)量要顯著高于共表達(dá)，但蛋白在表達(dá)量較高的情況下，部分蛋白形成沒(méi)有活性包涵體，往往活性的大小與表達(dá)量之間呈非線性關(guān)系。

本研究所采用雙酶法合成L-色氨酸最大優(yōu)勢(shì)在于，合成L-絲氨酸后不經(jīng)過(guò)分離、精制等步驟，直接用于L-色氨酸的合成，降低了成本。我們?cè)O(shè)計(jì)了兩種雙酶法合成L-色氨酸的途徑：雙菌雙酶法和單菌雙酶法。采用雙菌雙酶法合成L-色氨酸，由于兩種酶分別由兩種重組菌進(jìn)行表達(dá)，其表達(dá)的可溶性蛋白量和所產(chǎn)生的酶的活性都要優(yōu)于兩種酶共表達(dá)。此途徑中兩步酶促反應(yīng)前后分開進(jìn)行，每步反應(yīng)都可以在酶最適合的條件下進(jìn)行，前后兩步反應(yīng)不會(huì)互相影響，但反應(yīng)的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，而且反應(yīng)過(guò)程中需要離心、更換反應(yīng)罐等步驟，增加了成本。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用此途徑合成L-色氨酸，底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物累積量較高，從高效液相結(jié)果可知反應(yīng)副產(chǎn)物很少。針對(duì)雙菌雙酶法途徑，今后我們需要對(duì)兩種酶的最佳反應(yīng)條件(包括反應(yīng)的溫度、pH和原料用量等方面)作進(jìn)一步優(yōu)化，完善雙菌雙酶法的工藝，期望能提高L-色氨酸產(chǎn)量。單菌雙酶法的優(yōu)勢(shì)在于可大幅縮短產(chǎn)酶和酶促反應(yīng)的時(shí)間，且共表達(dá)基因工程菌所產(chǎn)兩種酶的酶活并不低。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示此途徑合成L-色氨酸的積累量遠(yuǎn)低于雙菌雙酶法，分析原因可能是在同一環(huán)境中反應(yīng)，需要兼顧兩種酶的反應(yīng)條件，使兩者都無(wú)法達(dá)到最高的原料利用率。因此，單菌雙酶法合成L-色氨酸工藝條件仍需繼續(xù)探究，包括提高兩種酶在同一重組菌中的表達(dá)量和酶活性，以及在合成反應(yīng)過(guò)程中使兩種酶同時(shí)達(dá)到相對(duì)最佳的活性，以期獲得更高的原料轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物累積量。

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Construction of co-expression SHMT and TPase recombinant vector and dual-enzymatic synthesis of L-tryptophan

Xin Li, Jun Liu, Qinqin Zhao, and Aicai Xu
College of Biological and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China

Received:November 18, 2009;Accepted:June 7, 2010

Supported by:Educational Commission of Hubei Province of China(No.D200718002).

Corresponding author:Jun Liu.Tel: +86-27-83956793; E-mail: Junliu85@yahoo.com.cn湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(No.D200718002)資助。