秦久福，高威威，李崎，李永仙，鄭飛云，劉春風，顧國賢

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122 2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 釀酒科學(xué)與工程研究室，無錫 214122

通過體外分子進化技術(shù)提高淀粉液化芽胞桿菌BS5582 β-1,3-1,4-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性

秦久福1,2，高威威1,2，李崎1,2，李永仙1,2，鄭飛云1,2，劉春風1,2，顧國賢2

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122 2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 釀酒科學(xué)與工程研究室，無錫 214122

應(yīng)用基于易錯PCR隨機突變的體外分子進化技術(shù)，來提高淀粉液化芽胞桿菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性。利用建立的基于96微孔板高通量篩選模型，經(jīng)過兩輪定向進化與高通量篩選，共篩選得到3株熱穩(wěn)定性明顯提高的突變體2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03。將野生型β-葡聚糖酶基因和熱穩(wěn)定性提高的突變基因的高效表達產(chǎn)物經(jīng)鎳親和層析柱純化后，酶學(xué)性質(zhì)測定表明突變酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T50值分別比野生酶(53℃)提高2.2℃、5.5℃和3.5℃。突變酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t1/2,60℃(min)分別比野生酶(18 min)提高4 min、13 min和17 min。突變酶 2-JF-01、2-JF-02 和 2-JF-03 的Vmax值為 286 μmol/(mg·min)、304 μmol/(mg·min)和 279 μmol/(mg·min)，分別比野生型下降8.3%、2.6%和10.6%。突變酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Km值分別為6.76 mg/mL、6.19 μmg/mL和6.84 mg/mL，與野生型(6.29 mg/mL)基本相同。序列分析表明，3個突變體共發(fā)生7個氨基酸替代：2-JF-01(N36S，G213R)、2-JF-02(C86R，S115I，N150G)和2-JF-03(E156V，K105R)。同源建模表明，7個氨基酸替代中5個位于蛋白質(zhì)表面或表面洞穴中，42.8%的替代氨基酸是精氨酸，也表明精氨酸在提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性中起重要的作用。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶，體外分子進化，易錯PCR，熱穩(wěn)定性

Abstract:In vitroevolution methods are often used to modify protein with improved characteristics.We developed a directed evolution protocol to enhance the thermostability of the β-1,3-1,4-glucanase.The thermostability of the enzyme was significantly improved after two rounds of directed evolution.Three variants with higher thermostability were obtained.The mutant enzymes werefurther analyzed by their melting temperature, halftime and kinetic parameters.Comparing to intact enzyme, the T50of mutant enzymes 2-JF-01, 2-JF-02 and 2-JF-03 were increased by 2.2°C, 5.5°C and 3.5°C, respectively, the halftime(t1/2,60°C)of mutant enzymes 2-JF-01, 2-JF-02 and 2-JF-03 were shortened by 4,13 and 17 min, respectively, theVmaxof mutant enzymes were decreased by 8.3%, 2.6% and 10.6%, respectively, whileKmof mutant enzymes were nearly unchanged.Sequence analysis revealed seven single amino acid mutant happened among three mutant enzymes, such as 2-JF-01(N36S, G213R), 2-JF-02(C86R, S115I, N150G)and 2-JF-03(E156V, K105R).Homology-modeling showed that five of seven substituted amino acids were located on the surface of or in hole of protein.42.8% of substituted amino acids were arginine, which indicated that arginine may play a role in the improvement of the thermostability of the β-1,3-1,4-glucanase.This study provide some intresting results of the structural basis of the thermostability of β-1,3-1,4-glucanase,and provide some new point of view in modifying enzyme for future industrial use.

Keywords:β-1,3-1,4-glucanase,vitroevolution, error-prone PCR, thermostability

β-1,3-1,4-葡聚糖屬植物細胞壁中的結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖，是以混合(1→3)和(1→4)β-糖苷鍵連接形成的D 型葡萄糖聚合物，它在大麥整粒和胚乳中的含量高達4.0%～8.0%[1-2]。β-1,3-1,4-葡聚糖酶葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是一種能夠有效水解β-1,3-1,4-葡聚糖的酶，它能水解其中的β-1,3鄰接的β-1,4鍵，其水解的主要產(chǎn)物為三糖(3-O-β-D-纖維二糖-D-葡萄糖)和四糖(3-O-β-D-纖維三糖-D-葡萄糖)。葡聚糖酶在工農(nóng)業(yè)中的用途廣泛，在啤酒工業(yè)中，β-葡聚糖酶可降低麥汁粘度，提高麥汁濾速及得率，改善啤酒風味，保持成品酒穩(wěn)定性[3]。β-葡聚糖酶在飼料工業(yè)中也有較廣泛的應(yīng)用，β-葡聚糖也被稱為谷物的重要抗營養(yǎng)因子，主要是因為單胃動物由于自身不具備合成β-葡聚糖酶的微生物及分解β-葡聚糖的酶系，使食糜在腸道中具有較高的粘度，而阻止蛋白質(zhì)和脂肪營養(yǎng)的吸收，降低飼料的轉(zhuǎn)化率，因此 β-葡聚糖也被稱為谷物的重要抗營養(yǎng)因子[4]，在飼料中添加β-葡聚糖酶，可以大大降低β-葡聚糖粘度，從而改善麥類營養(yǎng)價值，同時減少排泄物從而減輕對環(huán)境的污染。

然而，葡聚糖酶較差的熱穩(wěn)定性限制了它在工業(yè)生產(chǎn)中的使用，如在啤酒糖化和飼料造粒過程中易失去大部分酶活性[5]。因此提高 β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性具有一定實踐意義，不僅可穩(wěn)定 β-葡聚糖酶的工業(yè)應(yīng)用效果，而且可以此為基礎(chǔ)研究 β-葡聚糖酶結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。

定向進化技術(shù)是由美國Trost等于上世紀90年代初期開發(fā)出來的一項蛋白質(zhì)工程技術(shù)[6]。它是基因工程、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和計算機技術(shù)互補發(fā)展和滲透的結(jié)果，標志著人類可以按照自己的意愿和需要改造蛋白質(zhì)，甚至設(shè)計出自然界中原本不存在的全新蛋白質(zhì)。分子定向進化技術(shù)[7]，簡單地說就是在實驗室中對達爾文自然進化原理進行模擬，從而對目標蛋白進行改造。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是PCR和基因重組技術(shù)的應(yīng)用，定向進化已從在體內(nèi)轉(zhuǎn)為在體外進行，實驗方法也變得簡便、快速和高效[8-9]。體外展示技術(shù)等高通量篩選方法的發(fā)展更進一步拓展了體外定向進化的應(yīng)用范圍，使原本操作起來耗時耗力或難以進行直觀篩選的蛋白質(zhì)分子也能夠得到改造[10]。

近年來國內(nèi)外學(xué)者，大量運用體外分子進化技術(shù)，對堿性脂肪酶、木聚糖酶、β-糖苷酶以及 L-天門東酰胺酶[11]等多種工業(yè)用酶的性能進行了改造，取得較好的效果。對于 β-葡聚糖酶的研究，目前國內(nèi)外研究主要集中在酶的規(guī)?；苽浞矫鎇12-14]，而對于其性能的分子改造較少，尤其是在 β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性定向進化研究方面，尚未見相關(guān)報道。

本研究基于易錯PCR隨機突變技術(shù)對來自淀粉液化芽胞桿菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因bgl進行了分子改造，通過建立的基于 96微孔板高通量篩選模型，經(jīng)過兩輪定向進化與高通量篩選，共篩選得到3株熱穩(wěn)定性明顯得到提高的葡聚糖酶突變體，2-JF-01、2-JF-02和 2-JF-03，并初步分析了熱穩(wěn)定性提高的機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

文中使用的菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

1.1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶、dNTPs購自上海博彩生物科技有限公司；溶菌酶、蛋白酶K購自北京博大泰克有限公司；限制性內(nèi)切酶BamH I、XhoI、T4 DNA連接酶、λDNA、蛋白質(zhì) Marker、硫酸卡那霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購自上海生工生物工程公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，丙烯酰胺、亞甲雙丙烯酰胺為加拿大BBI公司產(chǎn)品；β-葡聚糖底物為美國Sigma公司產(chǎn)品；酵母提取物和胰蛋白胨為英國 Oxoid公司產(chǎn)品；其他未特別注明的試劑均為國產(chǎn)分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂粉15(固體培養(yǎng)基)，固體和液體培養(yǎng)基在需要時加入硫酸卡那霉素至 30 μg/mL。TB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 12，酵母提取物24，甘油6，NaCl 10，KH2PO42.4，K2HPO4·3H2O 12.5。培養(yǎng)基接種前加入卡那霉素溶液，終濃度為0.03 g/L。

1.2 方法

1.2.1 易錯PCR擴增

使用高濃度Mg2+和不均衡dNTPs濃度來進行易錯PCR，針對β-1,3-1,4-葡聚糖酶全基因，構(gòu)建隨機突變庫。根據(jù)淀粉液化芽胞桿菌bgl序列(GenBank Accession：M15674)設(shè)計合成PCR所需的引物。

設(shè)計引物如下：PAG1-F1：(5′-ACATCGGATCC ATGAAACGAGTGTTGCTAATTCTTG-3′，BamH I)和 PAG1-R：(5′-GTAGTCATCTCGAGTTATTTTTT TGTATAGCGCACCCAG-3′，XhoI)。以含bgl基因的質(zhì)粒pET28a(+)-bgl為模板，進行易錯PCR 擴增。每100 μL反應(yīng)體系為：1×TaqDNA聚合酶緩沖液、0.2 mmol/L dATP和 dGTP、1.0 mmol/L dCTP和dTTP、7 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L Mn2+、上下游引物各 50 pmol、Template DNA 1 μg、TaqDNA 聚合酶5 U。PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性50 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；4℃保溫。

1.2.2 突變體文庫的構(gòu)建

易錯PCR產(chǎn)物經(jīng)1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測后利用膠回收試劑盒回收。用限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI分別對載體pET28a(+)和易錯PCR產(chǎn)物進行消化，將bgl基因與線性化載體片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)，涂布硫酸卡那霉素(50 mg/L)抗性平板構(gòu)建突變體庫。

1.2.3 突變文庫的高通量篩選

從LB平板上挑選單個克隆子菌落接種于含有1 000 μL LB培養(yǎng)基(內(nèi)含30 μg/mL Kan)的96深孔板中，每孔對應(yīng)一特定轉(zhuǎn)化子。每塊深孔板同時接種野生型克隆，作為陽性對照。37℃、200 r/min振搖培養(yǎng) 12 h。在無菌條件下，從 96深孔板中取出20 μL菌液，對應(yīng)接入含1 000 μL新鮮LB培養(yǎng)基的另一96深孔板中，并進行37℃、200 r/min振搖培養(yǎng)。4℃臨時冷藏種子96深孔板。37℃、200 r/min振搖培養(yǎng)重組菌4 h后，每孔加入2 g/L IPTG 40 μL以及180 g/L乳糖100 μL，混勻后于24℃、200 r/min振搖培養(yǎng)6 h。在酶標儀上測定OD600并保存數(shù)據(jù)后于4℃、3 000 r/min離心20 min。以每孔一一對應(yīng)為原則，利用排槍快速移取 20 μL上清粗酶液至 2塊96 PCR反應(yīng)板中。將其中一塊含有粗酶液的96 PCR反應(yīng)板經(jīng)過80℃金屬浴處理0.5 h，另一對應(yīng)板4℃冷藏。將2塊96 PCR反應(yīng)板40℃預(yù)熱10 min后(利用酶標儀加熱模塊)，每孔中加入40℃藍色葡聚糖底物(使用前和pH 6.5的20 mmol/L的磷酸緩沖液1∶19混合)80 μL，混勻后40℃反應(yīng)10 min。每孔中加入300 μL沉淀液，利用Eppendorf低溫離心機，于4℃、3 000 r/min離心20 min，利用排槍移上清至2塊96反應(yīng)板中并測定OD590吸光值。利用酶標儀軟件計算每個克隆(OD590,未鈍化?OD590,熱鈍化)/OD600的數(shù)值(殘余活性)，以陽性對照為參考，將結(jié)果高于陽性對照的克隆挑出并進行斜面保藏。

1.2.4 高通量篩選方法的統(tǒng)計學(xué)分析

從野生型E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-bgl平板上挑取200個單菌落，在96深孔培養(yǎng)板上進行培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達后離心制得粗酶液，隨后進行β-1,3-1,4-葡聚糖酶活高通量測定?；跀?shù)值符合正態(tài)分布的原理，利用公式R=1?F((X0?μ)/σ)對篩選方法的精確性進行統(tǒng)計學(xué)分析，其中X0為人為設(shè)定的預(yù)期值，用來表示由實驗誤差導(dǎo)致假陽性的活力數(shù)值；μ為野生型β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力的平均值；R為所求假陽性出現(xiàn)的概率；σ為野生型β-1,3-1,4-葡聚糖酶活的標準方差。當確定單一基因庫標準方差(σ)和活力平均值(μ)后，預(yù)期值(X0)在96孔板中假陽性概率就可以被計算，以此作為衡量篩選方法精確性的依據(jù)。

1.2.5 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分離純化

純化過程全部在4℃下進行，離心收集的重組菌溶于pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中，超聲破碎后，離心取上清液，即為粗酶液。粗酶液按美國通用公司的 HisTrap HP affinity column親和層析方法進行純化，純酶液超濾濃縮后用于后續(xù)實驗。

1.2.6 β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力的測定

采用 3,5-二硝基水楊酸(DNS)法及改良 AZO測定方法相結(jié)合進行測定。藍色大麥葡聚糖底物法測定 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的原理見圖1。酶活定義：在40℃和 pH值為 6.5條件下，每分鐘水解β-葡聚糖生成相當于1 μmol的葡萄糖還原物質(zhì)的量為1個酶活力單位。帶藍色基團的大麥β-葡聚糖，在β-葡聚糖酶的作用下，由于 β-葡聚糖大分子中的β-1,3-1,4鍵的斷裂，將藍色基團釋放到反應(yīng)體系中，加入特定的沉淀液后，經(jīng)過離心，清液在590 nm處具有吸光值，且吸光值的大小直接與酶活力的高低成正比。具體測定步驟見Ekinci MS[15]等介紹方法。

圖1 藍色大麥葡聚糖底物法測定 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的原理示意圖Fig.1 Theoretical basis of the β-1,3-1,4-glucanase assay employing Azo-Barley Glucan.

1.2.7 野生酶和熱穩(wěn)定性提高突變體的Michaelis-Menten動力學(xué)分析

底物為 0～10 mg/mL的大麥 β-葡聚糖，溶解于0.02 mol/L的pH 6.5的磷酸緩沖液。在相同酶濃度下，于40℃測定β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力。以Lineweaver-Burk作圖法計算 Michaelis-Menten常數(shù)。從Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖中可得到動力學(xué)參數(shù)Km以及Vmax。

1.2.8 野生酶和熱穩(wěn)定性提高突變體的熱穩(wěn)定性測定

純化得到的酶液分別在 25℃～80℃的水浴中保溫10 min，立即冰浴20 min，按照1.2.5描述方法測定酶活力。記酶溶液不經(jīng)過鈍化處理時的酶活力為100%，以不同溫度對相應(yīng)的殘余酶活力百分比作圖，求出酶活力喪失50%時的溫度，即該酶的半失活溫度 T50。定義 β-1,3-1,4-葡聚糖酶特定溫度下酶活丟失一半的時間為其半衰期，記為t1/2,X℃。

1.2.9 淀粉液化芽胞桿菌BS5582 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)同源模擬與突變位點分析

在 SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫(http://swissmodel.expasy.org/workspace)中輸入 β-1,3-1,4-葡聚糖酶野生型以及突變酶的的氨基酸序列并選擇模板，生成同源模擬圖。借助 PYMOL蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析軟件并根據(jù)預(yù)測的結(jié)構(gòu)信息，分析其位點突變效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 易錯PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

易錯PCR隨機突變方法主要基于降低DNA聚合酶在擴增過程中的保真度而向靶基因中引入錯誤脫氧核糖核苷酸[6,16]。反應(yīng)體系中的 Mn2+濃度高低與DNA聚合酶保真性好壞直接相關(guān)。通過調(diào)節(jié)易錯PCR反應(yīng)體系Mn2+濃度可以實現(xiàn)對靶基因突變頻率進行精細調(diào)節(jié)，使其突變頻率穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)。本文對不同Mn2+濃度下bgl的突變頻率進行了研究，從表2中可以得知，易錯PCR反應(yīng)系統(tǒng)具有0.03%的凈突變，主要原因是TaqDNA聚合酶沒有3′→5′核酸外切酶活性進而影響其對 PCR反應(yīng)的校對功能[17]。靶基因的突變頻率隨著Mn2+濃度的增加而提高，如果突變頻率太高，產(chǎn)生的絕大多數(shù)酶將失去活性，如果突變頻率太低，野生型的背景太高，樣品的多樣性則較少。0.25 mmol/L至0.35 mmol/L的Mn2+濃度對我們所建立的隨機突變體系來說是比較合適的，可以使β-葡聚糖酶分子產(chǎn)生了2～3個氨基酸的替代。后期的進化與篩選實驗的結(jié)果也進一步表明，0.25～0.35 mmol/L的Mn2+濃度非常適合于bgl(717 bp)基因的定向進化。本研究亦對含不同濃度的易錯 PCR突變產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，由圖2可以看出，當Mn2+濃度大于0.25 mmol/L時，非突變產(chǎn)物的量明顯地高于突變產(chǎn)物的量，Mn2+氧化生成的微量Mn3+抑制了部分DNA聚合酶活性，可能是產(chǎn)生此結(jié)果的原因之一[18]。綜合考慮，本研究選擇0.25 mmol/L作為易錯PCR反應(yīng)體系Mn2+濃度。

表2 Mn2+濃度對bgl突變頻率的影響Table 2 The mutation rate of ep-PCR at different Mn2+concentration

圖2 Mn2+濃度對易錯PCR反應(yīng)體系產(chǎn)物的影響Fig.2 Effect of Mn2+concentration on the products of ep-PCR marker: DNA marker; control: standard PCR control;0.15: ep-PCR with 0.15 mmol/L of Mn2+; 0.25: ep-PCR with 0.25 mmol/L of Mn2+; 0.35: ep-PCR with 0.35 mmol/L of Mn2+;0.45: ep-PCR with 0.45 mmol/L of Mn2+.

2.2 高通量篩選方法的統(tǒng)計學(xué)分析

欲使酶的定向進化獲得成功，靈敏準確的高通量篩選方法(圖3)是其必要條件。為了檢驗96酶標板測定β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活的精確性，本研究從野生型E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-bgl平板上挑取200個單菌落，在96深孔培養(yǎng)板上進行培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達后離心制得粗酶液，隨后進行β-1,3-1,4-葡聚糖酶活高通量測定。結(jié)果表明，代表β-1,3-1,4-葡聚糖酶活OD590均數(shù) μ=0.63，其數(shù)據(jù)組標準差為±0.088(0.14 μ)，基于數(shù)值符合正態(tài)分布的原理，利用公式R=1?F((X0?μ)/σ)對篩選方法的精確性進行統(tǒng)計學(xué)分析，表觀為 2倍均數(shù)的假陽性出現(xiàn)概率為0.75×10?6當活力預(yù)期值為1.15倍于野生型總體均數(shù)，假陽性克隆的概率為1.7×10?4。研究結(jié)果表明，利用96酶標板進行β-1,3-1,4-葡聚糖酶活測定假陽性背景很低，可以有效地在定向進化中加以應(yīng)用。

2.3 突變體文庫的構(gòu)建及突變株的篩選和鑒定

在優(yōu)化確定的易錯PCR反應(yīng)體系下，進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測后利用膠回收試劑盒回收。用限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI分別對載體pET28a(+)和易錯PCR產(chǎn)物進行消化，將易錯bgl基因產(chǎn)物與線性化載體片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)，涂布硫酸卡那霉素(50 mg/L)抗性平板構(gòu)建突變體庫，質(zhì)粒構(gòu)建流程見圖3。按照上述文庫構(gòu)建及篩選方法對β-1,3-1,4-葡聚糖酶進行了兩輪進化，共完成對約4 500株克隆的初篩，得到活性比值提高突變體87株。隨后從相應(yīng)母 96培養(yǎng)板中挑取這些克隆在96孔板以及試管中進行多次復(fù)篩，定量比較這些突變株和野生型β-葡聚糖酶在80℃、30 min后的剩余活性。最終獲得熱穩(wěn)定性得到提高的3個突變體：2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03。

序列分析表明，3個突變體共發(fā)生 7個氨基酸替代(圖4)：2-JF-01(N36S，G213R)、2-JF-02(C86R，S115I，N150G)和 2-JF-03(E156V，K105R)?；赟WISS?MODEL 數(shù) 據(jù) (http://swissmodel.expasy.org/workspace)，對野生型及熱穩(wěn)定性提高突變體進行了蛋白三維結(jié)構(gòu)同源模擬。選擇的 PDB模板[19]為同源性與淀粉液化芽胞桿菌 BS5582 β-1,3-1,4-葡聚糖酶達到97%的1gbgA(1.80 ?)，同源建模的結(jié)果由 PROCHECK驗證。借助 PYMOL蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析軟件并根據(jù)預(yù)測的結(jié)構(gòu)信息，分析了 β-葡聚糖酶蛋白位點突變效應(yīng)。圖5三維結(jié)構(gòu)顯示，7個氨基酸替代中5個位于蛋白質(zhì)表面或洞穴中。

2.4 野生酶和熱穩(wěn)定性提高突變體的 Michaelis-Menten動力學(xué)分析

野生型及突變體β-1,3-1,4-葡聚糖酶按美國通用公司的HisTrap HP affinity column親和層析方法進行純化并經(jīng)超濾濃縮后用于動力學(xué)研究。突變酶2-JF-01、2-JF-02 和 2-JF-03 的Vmax值為 286 μmol/(mg·min)、304 μmol/(mg·min)和 279 μmol/(mg·min)，分別比野生型下降8.3%、2.6%和10.6%。突變酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Km值為6.76 mg/mL、6.19 μmg/mL和6.84 mg/mL，與野生型6.29 mg/mL基本相同(表3)。

圖3 易錯PCR介導(dǎo)的β-1,3-1,4-葡聚糖酶定向進化質(zhì)粒構(gòu)建流程Fig.3 Mutagenesis procedure of the β-1,3-1,4-glucanase structural gene bgl.

圖4 野生型及熱穩(wěn)定性提高突變體β-1,3-1,4-葡聚糖酶氨基酸序列比對Fig.4 Amino acid sequence alignment for variants 2-JF-01, 2-JF-02 and 2-JF-03, comparing to wide type β-1,3-1,4-glucanase.The alignment was performed by using the DNAMEN alignment programmer.Amino acid substitutions that differ from wide type are indicated in white.

表 3 野生酶和熱穩(wěn)定性提高突變體 β-1,3-1,4-葡聚糖酶動力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetic parameters of wide-type β-1,3-1,4-glucanase and its mutants

2.5 野生酶和熱穩(wěn)定性提高的突變酶的熱穩(wěn)定性測定

純化得到的酶液分別在 25℃～80℃的水浴中保溫10 min，立即冰浴20 min，按照1.2.5描述方法測定酶活力。記酶溶液不經(jīng)過鈍化處理時的酶活力為100%，以不同溫度對相應(yīng)的殘余酶活力百分比作圖，求出酶活力喪失50%時的溫度，即該酶的半失活溫度T50。β-1,3-1,4-葡聚糖酶特定溫度下酶活丟失一半的時間為其半衰期 t1/2,X℃。實驗結(jié)果表明(圖6)突變酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T50值分別比野生酶 53℃提高 2.2℃、5.5℃和 3.5℃，達到55.2℃、58.5℃和 56.5℃。突變酶 2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t1/2,60℃(min)分別比野生酶18 min提高4 min、13 min和17 min，達到22 min、31 min和 35 min。

3 討論

本研究對來源于淀粉液化芽胞桿菌 BS5582 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因bgl進行了定向進化，獲得3個熱穩(wěn)定性得到提高的突變體。序列分析表明，3個突變體共發(fā)生7個氨基酸替代。

酶學(xué)性質(zhì)及動力學(xué)性質(zhì)分析表明，熱穩(wěn)定性提高突變體β-1,3-1,4-葡聚糖酶對底物的親和力基本不變，但突變體相對于葡聚糖底物的催化活力下降明顯。雖然有研究報道，通過定向進化，酶的熱穩(wěn)定性和催化活性同時得到提高[8]，但以活性的損失來換取熱穩(wěn)定性的提高在定向進化中非常普遍。因為酶的活性是建立在其空間構(gòu)象的柔性基礎(chǔ)上的，而熱穩(wěn)定性正好相反，需要其構(gòu)象具有剛性，以抵御外力(高溫鈍化作用)的破壞[20]。因此很多情況下，一個酶的活性和其熱穩(wěn)定性是一種此消彼長的關(guān)系，本研究的結(jié)果也與之符合。

圖5 β-1,3-1,4-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性提高突變體氨基酸替代三維結(jié)構(gòu)定位Fig.5 Crystal structure of the wide-type β-1,3-1,4-glucanase(yellow cartoon)with the seven mutations(labeled and indicated by sticks)of the three variants selected in the directed evolution.The figure was made using PYMOL.

圖6 野生酶和熱穩(wěn)定性提高的突變酶 β-1,3-1,4-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性參數(shù)Fig.6 Thermostability parameters of wide-type β-1,3-1,4-glucanase and its mutants.aTemperature at which β-1,3-1,4-glucanase loses 50% activity upon incubation for 20 min.bHalf-life of 50°C inactivation.cHalf-life of 60°C inactivation.dHalf-life of 70°C inactivation A: the absolute value of T50and half-life.

最近有研究表明水解酶類的蛋白質(zhì)表面環(huán)形區(qū)域(loop)或 310螺旋的氨基酸殘基組成對于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性非常重要[20-22]，如在熱穩(wěn)定性較好的棲熱菌麥芽糖淀粉酶共有9個氨基酸替代，其中6個位于蛋白質(zhì)表面環(huán)形區(qū)域(loop)或 310螺旋中。本研究同源建模表明，7個氨基酸替代中的 5個位點位于蛋白質(zhì)表面環(huán)形區(qū)域(loop)、310螺旋或蛋白表面洞穴中，這有利于葡聚糖酶突變酶的熱穩(wěn)定性提高。

通過突變位點分析，顯示7個氨基酸替代中有3個突變成精氨酸(G213R、C86R和K105R)，占整個突變的比例為 42.8%。蛋白表面精氨酸突變熱點現(xiàn)象已見相關(guān)報道[11,23]，精氨酸的電荷分布、分子結(jié)構(gòu)及形成多重氫鍵的能力，使得它能與帶有負電荷的分子結(jié)合。因此，精氨酸在蛋白質(zhì)的外圍，能在帶電荷的環(huán)境下產(chǎn)生相互作用，從而維系蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。圖7顯示，86位的半胱氨酸突變?yōu)榫彼岷?，與其鄰近的85位的天冬氨酸及88位的谷氨酸形成鹽橋，在蛋白質(zhì)表面形成親水性離子簇從而加強了酶蛋白分子的穩(wěn)定性。

圖7 β-葡聚糖酶蛋白三維結(jié)構(gòu)中86位氨基酸的定位Fig.7 Location of mutations in the crystal structure of β-1,3-1,4-glucanase site 86Cys86 is surrounded by Asp85 and Glu88, resulting in a hydrophilic cluster.Substitution of the Cys increases the electrostatic interaction by forming salt bridge with Asp85 and Glu88.The figure was made using PYMOL.

本文所研究的葡聚糖酶蛋白分子中 115位的絲氨酸突變成異亮氨酸以及 156位的谷氨酸突變成纈氨酸，使突變酶蛋白更加穩(wěn)定，其原因可能是被替代的疏水氨基酸增加蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水核包裝密度，從而增加了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[24]。而第36位的天冬酰胺突變成絲氨酸后，與分子鄰近的38位的酪氨酸形成氫鍵，新產(chǎn)生的氫鍵也可能是突變酶蛋白穩(wěn)定性提高的原因之一。

本研究通過非理性方法(易錯 PCR)對 β-1,3-1,4-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性定向進化，一方面解釋了酶蛋白結(jié)構(gòu)與功能的信息，另一方面，結(jié)構(gòu)與功能的信息也為下一步的理性改造(定點突變)打下了堅實的基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1]Cantwell B.An analysis ofBacillus subtilisendo-beta-1,3-1,4-glucanase gene expression inEscherichia coli.Gene, 1983, 23(2): 211–219.

[2]Cantwell B, Brazil G, Hurley J,et al.Expression of the gene for the endo-beta-1,3-1,4-glucanase fromBacillus subtilisinSaccharomycescerevisia.J Inst Brew, 1985,91(3): 129–129.

[3]Gormley EP, Cantwell BA, Barker PJ,et al.Secretion and processing ofBacillussubtilisendo-beta-1,3-1,4-glucanaseinEscherichia coli.Mol Microbiol, 1988, 2(6):813–819.

[4]Asan M, Ozcan N.Expression of the beta-(1,3-1,4)-glucanase gene inStreptococcus salivariussubsp.thermophilus.Turk J Vet Anim Sci, 2007, 31(5): 319–324.

[5]Fukamizo T, Hayashi K, Tamoi M,et al.Enzymatic hydrolysis of 1,3-1,4-beta-glucosyl oligosaccharides by 1,3-1,4-beta-glucanase fromSynechocystisPCC6803: a comparison with assays using polymer and chromophoric oligosaccharide substrates.Arch Biochem Biophys, 2008,478(2): 187–194.

[6]Trost BM, Dumas J, Villa M.New strategies for the synthesis of vitamin-D metabolites via PD-catalyzed reactions.J Am Chem Soc, 1992, 114(25): 9836–9845.

[7]Giver L, Gershenson A, Freskgard PO,et al.Directed evolution of a thermostable esterase.Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(22): 12809–12813.

[8]Kim MS, Lei XG.Enhancing thermostability ofEscherichia coliphytase AppA2 by error-prone PCR.Appl Microbiol Biot, 2008, 79(1): 69–75.

[9]Leemhuis H, Nightingale KP, Hollfelder F.Directed evolution of a histone acetyltransferase-enhancing thermostability, whilst maintaining catalytic activity and substrate specificity.FEBS J, 2008, 275(22): 5635–5647.

[10]Emond S, Potocki-Veronese G, Mondon P,et al.Optimized and automated protocols for high-throughput screening of amylosucrase libraries.J Biomol Screen, 2007, 12(5):715–723.

[11]Kotzia GA, Labrou NE.Engineering thermal stability of L-asparaginase byin vitrodirected evolution.FEBS J,2009, 276(6): 1750–1761.

[12]Jung YJ, Yoo JS, Lee YS,et al.Purification and characterization of thermostable beta-1,3-1,4 glucanase fromBacillussp.a8-8.Biotechnol Bioproc E, 2007, 12(3):265–270.

[13]Hong MR, Kim YS, Joo AR,et al.Purification and characterization of a thermostable beta-1,3-1,4-glucanase fromLaetiporus sulphureusvar.miniatus.J Microbiol Biotechnol, 2009, 19(8): 818–822.

[14]Qiao JY, Dong B, Li YH,et al.Cloning of a beta-1,3-1,4-glucanase gene fromBacillus subtilisMA139 and its functional expression inEscherichia coli.Appl Biochem Biotech, 2009, 152(2): 334–342.

[15]Ekinci MS, McCrae SI, Flint HJ.Isolation and overexpression of a gene encoding an extracellular beta-(1,3-1,4)-glucanase fromStreptococcus bovisJB1.Appl Environ Microb, 1997, 63(10): 3752–3756.

[16]Matsumura I, Ellington AD.In vitroevolution of thermostable p53 variants.Protein Sci, 1999, 8(4):731–740.

[17]Zhao HM, Arnold FH.Directed evolution converts subtilisin E into a functional equivalent of thermitase.Protein Eng, 1999, 12(1): 47–53.

[18]Ghadessy FJ, Ong JL, Holliger P.Directed evolution of polymerase function by compartmentalized self-replication.Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(8): 4552–4557.

[19]Arnold K, Bordoli L, Kopp J,et al.The Swiss-model workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling.Bioinformatics, 2006, 22(2):195–201.

[20]Nakazawa H, Okada K, Onodera T,et al.Directed evolution of endo-glucanase III(Cel12A)fromTrichoderma reesei.Appl Microbiol Biot, 2009, 83(4):649–657.

[21]Liu D, Schmid RD, Rusnak M.Functional expression ofCandida antarcticalipase B in theEscherichia colicytoplasm-a screening system for a frequently used biocatalyst.Appl Microbiol Biot, 2006, 72(5): 1024–1032.

[22]Asako H, Shimizu M, Itoh N.Engineering of NADPH-dependent aldo-keto reductase fromPenicillium citrinumby directed evolution to improve thermostability and enantioselectivity.Appl Microbiol Biot, 2008, 80(5):805–812.

[23]Fang YW, Lu YJ, Lv FX,et al.Improvement of alkaline lipase from Proteus vulgaris T6 by directed evolution.Enzyme Micrb Tech, 2009, 44(2): 84–88.

[24]Mordukhova EA, Lee HS, Pan JG.Improved thermostability and acetic acid tolerance ofEscherichia colivia directed evolution of homoserine o-succinyltransferase.Appl Environ Microb, 2008, 74(24): 7660–7668.

Improvement of thermostability of β-1,3-1,4-glucanase from Bacillus amyloliquefaciens BS5582 through in vitro evolution

Jiufu Qin1,2, Weiwei Gao1,2, Qi Li1,2, Yongxian Li1,2, Feiyun Zheng1,2, Chunfeng Liu1,2,and Guoxian Gu2
1 The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China 2 Laboratory of Brewing Science and Tecnology, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

Received:February 8, 2010;Accepted:April 22, 2010

Supported by:Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period(Nos.2008BAI63B06,2007BAK36B01), National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2006AA020204), Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University(No.IRT0532).

Corresponding author:Qi Li.Tel: +86-592-2185869; Fax: +86-592-2184822; E-mail: liqi@jiangnan.edu.cn“十一五”國家科技支撐計劃(Nos.2008BAI63B06, 2007BAK36B01)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(No.2006AA)，長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃項目(No.IRT0532)資助。