馮云，任路靜，魏萍，仝倩倩，紀(jì)曉俊，黃和

南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009

微生物發(fā)酵產(chǎn)二十二碳六烯酸代謝機(jī)理的研究進(jìn)展

馮云，任路靜，魏萍，仝倩倩，紀(jì)曉俊，黃和

南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009

二十二碳六烯酸(簡(jiǎn)稱 DHA)是一種重要的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，對(duì)人體具有重要的生理功能。微生物發(fā)酵生產(chǎn)的DHA與魚油來(lái)源的DHA相比，具有諸多優(yōu)點(diǎn)，其發(fā)展前景廣闊。以下從發(fā)酵菌株、代謝途徑、關(guān)鍵酶以及油脂積累機(jī)制等方面進(jìn)行了綜述，為通過(guò)代謝工程等技術(shù)手段進(jìn)一步提高DHA產(chǎn)量提供了參考。

DHA，發(fā)酵，代謝途徑，機(jī)理

Abstract:Docosahexenoic acid(DHA)is an important polyunsaturated fatty acid which is beneficial to human health.Compared with the DHA derived from fish oil, DHA by microbial production possesses many advantages, and has a bright prospect.In this article, we reviewed strains, metabolic pathway, key enzymes and mechanism of lipid accumulation for microbial production of DHA.Those information would be greatly helpful for further improving DHA production by metabolic engineering.

Keywords:DHA, fermentation, metabolic pathway, mechanism

多不飽和脂肪酸(PUFAs)是指含有2個(gè)或2個(gè)以上雙鍵且碳鏈長(zhǎng)度為18或18個(gè)以上碳原子的直鏈脂肪酸。根據(jù)第一個(gè)雙鍵位置的不同，多不飽和脂肪酸可以分為ω-3型、ω-6型和ω-9型。其中，二十二碳六烯酸(Docosahexenoic acid，22:6△4,7,10,13,16,19，簡(jiǎn)稱 DHA)俗稱“腦黃金”，屬 ω-3型多不飽和脂肪酸，具有多種重要的生理功能。DHA是人類大腦和視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞膜的組成成分，對(duì)嬰幼兒視覺和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有至關(guān)重要的作用；同時(shí)它在預(yù)防高血壓、動(dòng)脈硬化、關(guān)節(jié)炎以及癌癥等疾病方面具有顯著功效[1]。一些國(guó)家的科研機(jī)構(gòu)建議，人們攝入的多不飽和脂肪酸至少應(yīng)占攝入總脂的3%[2]，應(yīng)提高膳食中ω-3型多不飽和脂肪酸的比例。因此，DHA被作為功能性因子添加到保健食品和功能食品飲料中。

長(zhǎng)期以來(lái)，DHA主要來(lái)源于深海魚油，但存在諸多缺點(diǎn)，如魚油質(zhì)量會(huì)隨著魚的種類、捕撈季節(jié)和地點(diǎn)的不同而不同，含 EPA、易受環(huán)境污染、有魚腥味、純化成本高等。20世紀(jì)提出的“單細(xì)胞油脂”、“微藻油”是以微生物作為來(lái)源發(fā)酵得到的含多不飽和脂肪酸的油脂，已成為當(dāng)前人們關(guān)注的熱點(diǎn)。通過(guò)微生物發(fā)酵法制備DHA，與傳統(tǒng)魚油來(lái)源相比，具有微生物生長(zhǎng)快，易于大規(guī)模培養(yǎng)；多不飽和脂肪酸含量高；不飽和脂肪酸成分單一，不含EPA或EPA含量低，易于分離純化；氧化穩(wěn)定性較好等優(yōu)點(diǎn)，因此微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA可替代魚油來(lái)源的DHA，具有廣泛的應(yīng)用前景。

1 生產(chǎn)DHA的微生物

目前，用于生產(chǎn)DHA的微生物主要是破囊壺菌Thraustochytrium、裂殖壺菌Schizochytrium和隱甲藻Crypthecodinium cohnii，研究情況見表1。

表1 發(fā)酵產(chǎn)DHA微生物研究情況Table 1 Strains for microbial production of DHA

破囊壺菌和裂殖壺菌都是屬于Straminipila界、Heterokonta門、Labyrinthulea 綱、Thraustochytriales目、Thraustochytriales科的異養(yǎng)海洋原生生物[14]，隱甲藻是屬于雙鞭藻類Dinoflagellate的異養(yǎng)海洋生物。其中裂殖壺菌分裂快、發(fā)酵周期短，是商業(yè)化生產(chǎn)DHA理想的生產(chǎn)菌之一。美國(guó)Martek公司利用Schizochytrium生產(chǎn)DHA，通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化調(diào)控，生物量干重達(dá)到170～210 g/L，其中50%是脂質(zhì)，脂質(zhì)中至少50%是DHA，最終DHA的產(chǎn)量高達(dá)40 g/L[15]，是至今報(bào)道的最高水平。本課題組利用1 500 L發(fā)酵罐，采取分階段溶氧調(diào)控策略，DHA產(chǎn)量達(dá)到37.75 g/L，產(chǎn)率為119 mg/(L·h)，在國(guó)內(nèi)處于領(lǐng)先水平[7]。

2 DHA合成途徑

目前，提高生產(chǎn)菌合成含DHA油脂的能力主要是通過(guò)傳統(tǒng)的生化工程途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)，即通過(guò)控制營(yíng)養(yǎng)條件和環(huán)境條件使代謝流流向脂質(zhì)合成的方向。而隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，對(duì)生產(chǎn)菌進(jìn)行遺傳改造為從根本上提高DHA合成能力提供了可能。但遺傳改造的前提是明確這些生產(chǎn)菌中 DHA的合成途徑，因此微生物體內(nèi)DHA合成途徑及其機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)內(nèi)容。

2.1 脂肪酸合成酶(FAS)途徑

在細(xì)胞質(zhì)中脂肪酸合成酶 FAS(Fatty acid synthase)的作用下，由乙酰-輔酶A和丙二酸單酰-輔酶A經(jīng)過(guò)縮合、還原、脫水、還原的循環(huán)，先合成16碳或18碳的飽和脂肪酸，然后在線粒體或微粒體上經(jīng)過(guò)一系列延長(zhǎng)酶和去飽和酶的交替作用最終合成長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，如 γ-亞麻酸、花生四烯酸、DHA等(圖1)。

圖1 DHA合成的脂肪酸合成酶途徑[16]Fig.1 Fatty acid synthase pathway for DHA biosynthesis[16].

脂肪酸合成酶是一個(gè)由多種酶構(gòu)成的多酶復(fù)合體，包括?；D(zhuǎn)移酶、烯酰ACP還原酶、脫水酶、酮酰ACP還原酶、酮酰ACP合成酶、磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶和?；d體蛋白ACP。不同生物組織內(nèi)該酶的結(jié)構(gòu)形式略有不同，在動(dòng)物中，該多酶復(fù)合體包含的所有酶定位于一個(gè)多肽鏈上；而在真菌中，這些酶分別定位為 2個(gè)功能的多肽鏈上。通過(guò)氨基酸序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，DHA生產(chǎn)菌中的脂肪酸合成酶與真菌中脂肪酸合成酶具有較高的同源性[17]。

此外，該途徑中的延長(zhǎng)酶和多種去飽和酶已經(jīng)得到克隆、純化和表達(dá)，如高山被孢霉Mortierella alpina中將 γ-亞麻酸(18:3ω-6)轉(zhuǎn)化成雙高亞麻酸(20:3ω-6)的延長(zhǎng)酶[18]，魯西毛霉Mucor rouxii中的△ 6 去飽和酶[19]，其中還包括一直備受爭(zhēng)議的△4去飽和酶。為了探究△4去飽和酶是否存在，研究者們采用能夠在體內(nèi)積累 DHA(22:6ω-3)和 DPA(22:5ω-6)的破囊壺菌為研究對(duì)象進(jìn)行了一系列研究，最終證明了△4去飽和酶的存在并闡明了其功能[20-24]。Thraustochytriumsp.的fad4基因編碼△4去飽和酶，將fad4基因與表達(dá)載體連接構(gòu)建出重組表達(dá)載體，分別導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞和畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞可以利用外源添加的底物生成DHA。同時(shí)，放射性同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)Thraustochytriumsp.中確實(shí)存在△4去飽和酶，可以把外源提供的14C標(biāo)記的 22:5(ω-3)轉(zhuǎn)化成DHA。但是Thraustochytriumsp.中的△4去飽和酶是位于微粒體還是線粒體仍不確定，有待繼續(xù)研究[25]。

2.2 多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶途徑

Thraustochytriales科的裂殖壺菌不能將外源標(biāo)記的22:5(ω-3)轉(zhuǎn)化成DHA[21]，因此裂殖壺菌可能不是通過(guò)傳統(tǒng)的FAS途徑合成DHA。Metz等[26]對(duì)ShewanellaSCRC2738和Schizochytriumsp.的基因組成進(jìn)行研究，結(jié)果表明，ShewanellaSCRC2738的一段基因上存在5個(gè)開放閱讀框，框中至少11個(gè)區(qū)域是編碼酶的功能域，其中有8個(gè)功能域與PKS合成酶(Polyketide synthase)密切相關(guān)，Schizochytriumsp.的基因片段中也存在同樣的結(jié)構(gòu)域，由此提出Schizochytrium合成 DHA的途徑類似于細(xì)菌中的PKS途徑，稱為PUFA合成酶途徑。

圖2 DHA合成的多不飽和脂肪酸合成酶途徑[25]Fig.2 Polyunsaturated fatty acid synthase pathway for DHA biosynthesis[25].KS: β-ketoacyl synthase; KR: β-ketoacyl-ACP reductase; D/I: dehydrase/isomerase; ER: enoyl reducatase.

該途徑中也存在一個(gè)類似于脂肪酸合酶的多酶復(fù)合體——PKS合成酶，主要存在于海洋細(xì)菌和一些能合成多不飽和脂肪酸的真菌中[27]，它包括β-酮酰合成酶、β-酮酰-ACP還原酶、烯酰還原酶、脫水酶/異構(gòu)酶、?；D(zhuǎn)移酶和?；d體蛋白。在該多酶復(fù)合體作用下，乙酰-輔酶 A和丙二酸-單酰輔酶 A作為基本單位，通過(guò)縮合、還原、脫水、還原/異構(gòu)的循環(huán)，合成DHA(圖2)。與FAS途徑一樣，該途徑也是以?；d體蛋白(ACP)作為延長(zhǎng)碳鏈的共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)。但由于PKS合成酶與FAS合成酶在酶的組成上略有不同，PKS合成酶中存在一個(gè)脫水酶/異構(gòu)酶，因此PKS途徑不存在需氧去飽和引入雙鍵的過(guò)程，而是在碳鏈延長(zhǎng)過(guò)程中直接形成雙鍵。

從表 2中列舉的相關(guān)研究可以看出，Schizochytrium中DHA確實(shí)是通過(guò)PUFA合成酶途徑合成，但是仍有許多問(wèn)題沒有解決，如裂殖壺菌中DPA(ω-6)是如何形成的；分類地位非常接近的破囊壺菌和裂殖壺菌中DHA合成途徑不相同，而二者的脂肪酸組成卻很相似[16]，因此確切的 DHA合成機(jī)制還有待深入研究。

表2 多不飽和脂肪酸合成酶途徑的研究概況Table 2 Studies of polyunsaturated fatty acid synthase pathway

3 DHA油脂積累機(jī)制

了解微生物油脂積累機(jī)制，特別是DHA合成途徑中的關(guān)鍵酶，從而在分子水平上調(diào)控關(guān)鍵酶，對(duì)于發(fā)酵過(guò)程中脂質(zhì)含量和 DHA產(chǎn)量的提高是極其重要的。

3.1 前提條件

乙酰輔酶A是脂肪酸合成的前體物質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中持續(xù)產(chǎn)生乙酰輔酶A是油脂積累的前提條件之一。發(fā)酵過(guò)程中為了達(dá)到油脂積累的目的，通常將微生物培養(yǎng)在碳氮比高的培養(yǎng)基中，當(dāng)?shù)春谋M后，微生物可以繼續(xù)吸收碳源，用于脂質(zhì)合成。在產(chǎn)油酵母和部分真菌的培養(yǎng)過(guò)程中氮源的減少，可以引起細(xì)胞內(nèi)的一系列反應(yīng)(圖3)[16]，本課題組通過(guò)對(duì)代謝通量的分析也發(fā)現(xiàn)，氮減少后引起代謝流的遷移，使細(xì)胞內(nèi)大量積累的乙酰輔酶A進(jìn)入脂肪酸的合成[31]。

油脂積累的另一個(gè)前提條件是在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生足夠的NADPH，為脂肪酸合成提供還原力。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中添加蘋果酸，可以促進(jìn) NADPH的生成，產(chǎn)生的總油脂與未添加相比提高了15%，脂肪酸中DHA含量從35%提高到60%[1]。

此外，本課題組利用亞硝基胍(NTG)和紫外照射對(duì)Schizochytriumsp.CCTCC M209059進(jìn)行復(fù)合誘變，得到突變株Schizochytriumsp.HX-308M，通過(guò)對(duì)突變株的酶活分析可以看出，與野生型菌株相比，突變株中產(chǎn)乙酰輔酶A和NADPH的酶活力提高，細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A和NADPH的量顯著增加，脂肪酸中DHA含量高達(dá)56.22%，比野生型菌株提高了38.88%[32]。由此可以看出，盡管破囊壺菌和裂殖壺菌中 DHA合成途徑不同，但乙酰輔酶 A和NADPH是油脂有效積累的關(guān)鍵因素。

圖3 氮限制引起的生理生化反應(yīng)Fig.3 Physiological and biochemical responses to nitrogen limitation.

3.2 關(guān)鍵酶

檸檬酸裂解酶(ACL，EC 4.1.3.8)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC，EC 6.4.1.2)和蘋果酸酶(ME，EC 1.1.1.40)是啟動(dòng)脂肪酸合成的3個(gè)關(guān)鍵酶(圖4)。

ACL催化檸檬酸裂解，反應(yīng)如下，該酶催化的反應(yīng)是脂肪酸合成所需乙酰-CoA的來(lái)源。

檸檬酸 + CoA + ATP →乙酰-CoA+草酰乙酸+ADP+Pi

ACC催化乙酰-CoA生成丙二酸單酰-CoA，是脂肪酸合成的起始步驟。分離編碼ACC的基因并使其在受體菌中過(guò)表達(dá)，ACC活性顯著升高并且丙二酸單酰-CoA大量增加，脂肪酸合成速率提高但是含量并沒有顯著增加，說(shuō)明該酶催化的反應(yīng)的確是脂肪酸合成的限速步驟，但脂肪酸含量的提高還受其他步驟的制約。

圖4 脂肪酸合成的前體及涉及的關(guān)鍵酶Fig.4 Precursors for fatty acid synthesis and key enzymes involved in fatty acid synthesis.MDH: malate dehydrogenase; PDH:pyruvatedehydrogenase; CS: citrate synthase; ICDH: isocitrate dehydrogenase; G6PDH: glucose-6-phosphate dehydrogenase.

蘋果酸酶催化蘋果酸分解生成丙酮酸，同時(shí)將NADP+還原成NADPH，為脂肪酸合成提供還原力。有相關(guān)研究表明，上面提到的2種酶都與脂質(zhì)的積累程度無(wú)關(guān)，而蘋果酸酶活性的有無(wú)以及活性高低都與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累的程度密切相關(guān)[33-34]。Song等[35]對(duì)蘋果酸酶構(gòu)型的研究表明，蘋果酸酶的6種異構(gòu)體中構(gòu)型Ⅳ與脂質(zhì)積累有關(guān)，構(gòu)型Ⅲ和Ⅳ由同一基因編碼，構(gòu)型Ⅳ是構(gòu)型Ⅲ在氮限制(以葡萄糖為碳源)或乙酸為唯一碳源的條件下啟動(dòng)的后轉(zhuǎn)錄修飾形成的。目前有關(guān)研究主要是以產(chǎn) γ-亞麻酸的絲狀真菌——卷枝毛霉為研究對(duì)象進(jìn)行的，日后可以針對(duì)裂殖壺菌等產(chǎn) DHA微生物內(nèi)的蘋果酸酶等關(guān)鍵酶進(jìn)行研究，進(jìn)一步明確它們與脂質(zhì)積累和DHA合成之間的關(guān)系，為DHA產(chǎn)量的提高提供理論基礎(chǔ)。

4 研究展望

近年來(lái)隨著對(duì) DHA生理及藥用價(jià)值的深入研究，其預(yù)防心血管疾病、高血壓、抗癌等生理功能也廣泛為人們所接受，DHA的需求量大幅增加，DHA保健品和含DHA的功能食品、飲料等產(chǎn)品具有巨大的市場(chǎng)潛力。因此只有實(shí)現(xiàn)DHA的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，提高 DHA產(chǎn)量和質(zhì)量才能滿足人們對(duì)DHA的需求。

提高DHA產(chǎn)量一直是微生物發(fā)酵產(chǎn)DHA研究的重點(diǎn)內(nèi)容?，F(xiàn)階段的研究主要集中于培養(yǎng)條件和發(fā)酵條件的優(yōu)化，這在一定程度上可以提高DHA的產(chǎn)量，但是效果并不明顯，而代謝工程是從根本上提高DHA產(chǎn)量的重要途徑。以上有關(guān)DHA合成途徑、關(guān)鍵酶和油脂積累機(jī)理的研究是利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段提高DHA發(fā)酵水平的基礎(chǔ)和前提，今后的研究應(yīng)該從以下幾個(gè)方面展開：

1)繼續(xù)深入研究 DHA合成途徑，從而有針對(duì)性地對(duì)現(xiàn)有生產(chǎn)菌進(jìn)行基因改造，選育DHA高產(chǎn)菌株，使其最大量的合成DHA。

2)進(jìn)一步研究 DHA合成途徑中的關(guān)鍵酶，分離并克隆關(guān)鍵酶基因，在分子水平對(duì)其進(jìn)行調(diào)控和表達(dá)，從而提高DHA產(chǎn)量。

3)考察環(huán)境條件變化對(duì)細(xì)胞內(nèi)能荷、還原力、關(guān)鍵代謝酶系酶活以及油脂積累的影響，從而獲得DHA高效積累策略，提高DHA產(chǎn)率。

4)利用微生物油脂積累機(jī)理指導(dǎo)發(fā)酵，優(yōu)化發(fā)酵工藝，從而使代謝流流向所需的目標(biāo)產(chǎn)物，進(jìn)一步提高DHA發(fā)酵水平。

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Progress in metabolic mechanism of docosahexenoic acid production by fermentation

Yun Feng, Lujing Ren, Ping Wei, Qianqian Tong, Xiaojun Ji, and He Huang
State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China

Received:May 9, 2010;Accepted:July 12, 2010

Supported by:Key Program of National Natural Science Foundation of China(No.20936002), National Basic Research and Development Program of China(973 Program)(Nos.2007CB707805, 2009CB724700), the Fifth of Six Projects Sponsoring Talent Summits of Jiangsu Province(No.2008-D-63),College Industrialization Project of Jiangsu Province(No.JH09-30).

Corresponding author:He Huang.Tel: +86-25-83172094; E-mail: biotech@njut.edu.cn國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.20936002)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(Nos.2007CB707805, 2009CB724700)，江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目(No.2008-D-63)，江蘇省高?？蒲谐晒a(chǎn)業(yè)化推進(jìn)項(xiàng)目(No.JH09-30)資助。