關(guān)鍵 程宗生 王健平 李德超 鄧慧鑫

（佳木斯大學口腔醫(yī)院 口腔頜面外科，黑龍江 佳木斯 154004）

從Codivilla介紹牽張成骨術(shù)（distraction osteogenesis，DO）至今已有一百多年的歷史，但目前對牽引產(chǎn)生的機械力如何轉(zhuǎn)化為生物學信號的細胞和分子機制尚不清楚。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）參與DO中新骨的生成并發(fā)揮重要作用[1-3]，其可能參與DO力學信號向生物信號轉(zhuǎn)化過程[4-5]。BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在成骨細胞對機械力刺激響應(yīng)中的作用還不清楚，對該問題的研究將為DO外源性應(yīng)用BMP提供理論基礎(chǔ)。本研究旨在通過生理狀態(tài)和阻斷BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路時，在mRNA層面對比研究成骨細胞株MC3T3-E1中Runx2對機械離心力刺激的響應(yīng)，從側(cè)面探討B(tài)MP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在成骨細胞對機械力刺激響應(yīng)中的作用和意義。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

小鼠胚成骨細胞株MC3T3-E1（中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)所細胞中心），DMEM（GIBCO公司，美國），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），重組小鼠Noggin蛋白（Perpro Tech公司，美國），Trizol（上海生工公司），cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Power SYBRRGreen PCR試劑盒、ABI7300 PCR儀（ABI公司，美國），50 bp DNA Marker（TaKaRa公司，日本），細胞培養(yǎng)瓶/板（Coring公司，美國）。

1.2 MC3T3-E1細胞的培養(yǎng)

37℃、5%CO2、含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)MC3T3-E1細胞，隔天換液。當細胞鋪滿瓶底80%以上時，37℃下0.25%胰蛋白酶1.5 mL消化3～5 min，見瓶底出現(xiàn)針孔樣透明時，加入等量含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打細胞制成細胞懸液，按1∶3傳代，第2天換液。

1.3 細胞加力

自制六孔細胞培養(yǎng)板離心支架，使之能將匹配的六孔板一起固定于LXJ-Ⅱ型離心沉淀機中離心，離心加力系統(tǒng)的剖面見圖1。根據(jù)公式：離心力（RCF）=1.118×10-5×R×V2計算離心力的大小，單位為重力加速度×g。離心半徑R約19 cm，轉(zhuǎn)速V約1 100 r·min-1，離心力約271×g。

圖1 離心加力系統(tǒng)的剖面圖Fig 1 Centrifugal profiles based augmentation systems

1.4 加力分組

將待測細胞隨機分為A、B、C、D組。A組為空白對照組，細胞未接受Noggin預(yù)處理和機械離心力加載；B組為細胞接受271×g離心力加載5 min；C組為細胞接受100 ng·mL-1Noggin預(yù)處理24 h；D組為細胞接受100 ng·mL-1Noggin預(yù)處理24 h和271×g離心力加載5 min，每組6孔。4組細胞同時種板，培養(yǎng)48 h后以無血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同步細胞周期。加力前24 h更換為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，將六孔板無菌密封。30min后4組分別收獲細胞。

1.5 Runx2表達的檢測

按Trizol試劑說明提取細胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用Power SYBR?Green染料法進行PCR，引物由Invitrogen公司合成，目的基因Runx2（Gene-Bank accession number NM_004348）上游引物序列為：5′-TCCAACCCACGAATGCACTAC-3′，下游引物序列為：5′-GTAGTGAGTGGTGGCGGACT-3′，擴增產(chǎn)物片段為92 bp；內(nèi)參對照β-actin（GeneBank accession number NM_007393）上游引物序列為：5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′，下游引物序列為：5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′，擴增產(chǎn)物片段為171 bp。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，95℃ 15 s，62℃ 1 min，共40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物同期進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 Runx2對離心力刺激的響應(yīng)

MC3T3-E1細胞中Runx2 mRNA的檢測結(jié)果見圖2。由圖2可見，B組Runx2 mRNA表達較A組增加（P<0.05），離心力可使Runx2 mRNA表達增加。D組經(jīng)Noggin預(yù)處理后比B組對離心力刺激時Runx2 mRNA表達降低（P<0.05），Noggin抑制Runx2 mRNA的表達。C組Runx2 mRNA表達無明顯變化，A、C、D組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.692）。

圖2 成骨細胞Runx2 mRNA的表達Fig 2 The expression of Runx2 mRNA in osteoblastic MC3T3-E1 cells

2.2 實時熒光定量PCR產(chǎn)物電泳分析

凝膠電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物雜帶少，RT-PCR產(chǎn)物純度較高（圖3）。

圖3 Runx2表達產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig 3 The electrophoresis results of expression product of Runx2

3 討論

成骨細胞是骨組織內(nèi)的力學敏感性細胞，同時它在骨改建過程中又處于一個中心調(diào)控的地位，是研究骨形成機制的基本單位[6-7]。MC3T3-E1細胞表型穩(wěn)定，使其在對成骨細胞的各項研究中得到了廣泛地應(yīng)用。目前對離體細胞有多種加力方式：低滲性膨脹、離心、單/雙向拉伸和流體剪切等，這些不同的離體應(yīng)變使細胞產(chǎn)生不同的生理響應(yīng)過程。本實驗的離心加力方式與Fitzgerald等[8]所提出的類似，離心力使貼壁生長的細胞受到一個頂—底軸向的壓力，避免了細胞懸浮離心時細胞之間以及細胞與基質(zhì)之間附著狀態(tài)的喪失。Fitzgerald等[8]發(fā)現(xiàn)對MC3T3-E1細胞加載3×g的離心力相當于輕微力量，而287×g的離心力則相當于劇烈刺激的力量。前期實驗表明對MC3T3-E1細胞加載271×g的離心力5 min能有效刺激成骨細胞，并且離心力刺激強度在成骨細胞生理范圍之內(nèi)。離心力在一定程度上反映成骨細胞受到機械力學刺激作用，但是無法完全模擬體內(nèi)DO成骨細胞的實際受力情況。

成骨細胞對力學信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)通過胞膜上Ca2+通道、胞外基質(zhì)-整合素-細胞骨架結(jié)構(gòu)系統(tǒng)[9]、細胞因子等多種途徑入核作用于靶基因Runx2并調(diào)控相應(yīng)基因表達構(gòu)成復(fù)雜的力學信息傳遞網(wǎng)絡(luò)。本研究結(jié)果顯示：與A組相比，B組Runx2 mRNA表達增加，可能為成骨細胞對機械離心力刺激響應(yīng)的結(jié)果，驗證了Runx2作為力學信號靶分子參與了成骨細胞響應(yīng)機械離心力刺激的生理過程。Ziros等[10]證實Runx2/Cbfa1蛋白及基因都是力學刺激的關(guān)鍵目標，認為Runx2/Cbfa1基因表達的增強是力學刺激在成骨細胞內(nèi)作用的“終點”。Li等[11]對成骨樣細胞施加離心力10 min后檢測到Runx2/Cbfa1 mRNA表達水平有短暫地增加改變，認為成骨細胞通過多種復(fù)雜途徑響應(yīng)機械力學刺激。

采用Abe等[12]的方法阻斷BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使用100 ng·mL-1Noggin預(yù)處理24 h，其Runx2 mRNA表達水平可反映Noggin阻斷BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的效果，結(jié)果顯示，C組與A組和D組間差異無統(tǒng)計學意義，認為D組達到了阻斷BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的要求。D組Runx2 mRNA表達水平略高于A組，可能是除BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路外，其他信號通路對機械離心力刺激響應(yīng)的效果。

D組Runx2 mRNA表達水平較B組顯著降低。僅阻斷BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從現(xiàn)有理論來講，其他多種力學信號傳遞途徑應(yīng)不受影響，但是BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻斷后，力學靶點Runx2基因在相同的力學刺激強度下未能完成與B組同等的響應(yīng)程度，二者對機械離心力刺激響應(yīng)程度的差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了成骨細胞對機械離心力刺激的生理響應(yīng)過程，而且可能在成骨細胞對力學信號引起的信息傳遞級聯(lián)反應(yīng)中扮演了重要角色。力學刺激可能通過BMP/Smad途徑[13-15]或BMP/p38MAPK途徑[16-17]等入核作用于Runx2等影響成骨特異性基因表達，從而刺激骨形成以響應(yīng)力學刺激，但其具體機制尚不清楚。BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在成骨細胞對機械力刺激響應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能介導(dǎo)力學信息傳遞網(wǎng)絡(luò)的其他途徑，并在力學刺激引起的信息傳遞級聯(lián)反應(yīng)中扮演重要角色，但還需要進一步研究驗證。

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