趙蘭平，王雪芳，陳彥靜，杜會博，胡興光，季振慧

(1河北北方學院生理教研室，河北張家口075000;2河北師范大學校醫(yī)院，河北石家莊050091)

胺碘酮對低O2、酸中毒及腎上腺素條件下豚鼠左心室流出道自律細胞電活動的影響*

趙蘭平1△，王雪芳1，陳彥靜1，杜會博1，胡興光1，季振慧2

(1河北北方學院生理教研室，河北張家口075000;2河北師范大學校醫(yī)院，河北石家莊050091)

目的:研究胺碘酮對豚鼠左心室流出道自律細胞電活動的影響以及胺碘酮對低O2、酸中毒和腎上腺素(EPI)所致該部位自律性改變的影響。方法:采用標準玻璃微電極細胞內(nèi)電位記錄技術，分別觀測胺碘酮對豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應電位的影響，以及胺碘酮對無糖低氧、pH6.8和EPI導致的該電位改變的影響。結果:(1)0.1 μmol/L胺碘酮可使左心室流出道自發(fā)慢反應電位自發(fā)放電頻率(RPF)減慢，最大舒張電位(MDP)絕對值減小，復極80%時間(APD80)延長(P＜0.05);1 μmol/L胺碘酮可引起4相自動除極速度(VDD)和0相最大除極速度(Vmax)減慢，動作電位幅度(APA)減小，復極50%時間(APD50)延長(P＜0.05)，RPF減慢，MDP減小和APD80延長(P＜0.01);10 μmol/L胺碘酮可使VDD進一步減慢，APA進一步減小(P＜0.01)，其它指標的改變維持1 μmol/L胺碘酮灌流時的水平。(2)低O2可使VDD、RPF和Vmax減慢，MDP和APA減小，APD50縮短(P＜0.05);和低O2組相比，1 μmol/L胺碘酮+低O2可使RPF和Vmax進一步減慢，MDP增大，APD80延長(P＜0.05)，VDD進一步減慢，APD50延長(P＜0.01)。(3)pH6.8的灌流液可使VDD和RPF減慢，APD80縮短(P＜0.05)，Vmax減慢，APA減小(P＜0.01);與pH6.8組相比，pH6.8的1 μmol/L胺碘酮可使RPF進一步減慢，MDP和APA進一步減小，APD80延長(P＜0.05)，VDD進一步減慢，APD50延長(P＜0.01)。(4)10 μmol/L EPI可使VDD、RPF和Vmax加快，MDP增大，APD50和APD80縮短(P＜0.05)，APA增大(P＜0.01);1 μmol/L胺碘酮+10 μmol/L EPI可使VDD和RPF減慢，MDP和APA減小，Vmax減慢，APD50和APD80延長(P＜0.05，P＜0.01)。結論:胺碘酮可降低豚鼠左心室流出道的自律性，同時對低O2、酸中毒和EPI所致的該部位自律性改變有一定的影響。

胺碘酮;低氧;酸中毒;腎上腺素;左心室流出道;自發(fā)節(jié)律細胞

近年來的研究表明，臨床上常見的室性期前收縮和特發(fā)性室性心動過速往往與右心室流出道的結構和功能異常有直接關系。我室在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，由魚及兩棲類心臟上位于心室之后，具有獨立興奮和收縮功能的動脈球(bulbus cordis)部分演化而來的心室流出道組織，仍保留有動脈球階段的一些電生理特性，如仍存在慢反應自律細胞和具有獨立興奮能力［1］。進一步的研究表明，流出道自律細胞與竇房結起搏細胞具有相似的特征和離子流基礎［2，3］，而且其電活動可能受自主神經(jīng)的調(diào)控［4］，故可推測源于流出道的心律失?？赡転樽灾魃窠?jīng)功能紊亂和體液中的兒茶酚胺(catecholamine，CA)分泌異常導致自律性異常所致。胺碘酮(amiodarone，Ⅲ類抗心律失常藥物)在多項臨床實驗中被證明有良好的抗心律失常作用而成為治療心律失常的主要藥物之一。為了深入探討心室流出道的電活動與心律失常的關系，本實驗采用標準玻璃微電極細胞內(nèi)記錄技術，觀測了胺碘酮對豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應電位的影響，在此基礎上，記錄并分析了胺碘酮對低O2、酸中毒和腎上腺素(epinephrine，EPI)所致該部位自律細胞電生理效應的影響，期望對深入探討心室流出道的電生理特性提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 標本制備

健康豚鼠，250－350 g，開胸取出心臟，并用O2飽和的改良Locke液(mmol/L:NaCl 157，KCl 5.6，CaCl22.1，NaHCO31.8，葡萄糖5.6，pH7.3－7.4)經(jīng)冠脈進行灌注沖洗后，從主動脈瓣的左瓣與后瓣間向下剪開心室，保留各瓣膜完整，并以此為寬度，向下切取約4 mm的前庭組織制成標本。制好的標本用不銹鋼針固定于灌流槽(1.5 cm×2 cm)內(nèi)的硅橡膠上。用O2飽和的改良Locke液進行恒溫(35℃±1℃)、恒速(10 mL/min)灌流，標本在灌流液中穩(wěn)定30 min后開始實驗。

2 電位引導

玻璃微電極充以飽和KCl電極液后直流電阻為10－20 ΜΩ。如能直接記錄到自發(fā)電位，則不再進行刺激，若記錄不到，則將刺激電極置于標本遠離瓣膜一端的心肌組織上，給予波寬2 ms、1 Hz、2倍閾強度的方波刺激(YC－2型程控刺激器，成都儀器廠)，刺激時間由數(shù)秒至數(shù)分鐘不等，直至誘發(fā)出穩(wěn)定的自發(fā)節(jié)律，即停止電刺激開始實驗。引導出的自發(fā)慢反應電位，經(jīng)SWF－1B高阻抗微電極放大器放大，一路輸入監(jiān)聽器監(jiān)聽，另一路采用RM6280多道生理信號采集處理系統(tǒng)，自動顯示電信號，并分析自發(fā)慢反應電位的各項參數(shù)指標。

3 觀測指標

4 相自動除極速度(velocity of diastolic depolarization，VDD)、自發(fā)放電頻率(rate of pacemaker firing，RPF)、最大舒張電位(maximal diastolic potential，MDP)、0相最大除極速度(maximal rate of depolarization，Vmax)、動作電位幅度(amplitude of action potential，APA)、復極50%和80%時間(50%and 80%of duration of action potential，APD50and APD80)。

4 實驗過程和分組

待自發(fā)節(jié)律穩(wěn)定10 min后，開始采集正常的自發(fā)慢反應電位為對照組，然后改用含有一定濃度的藥液灌流(為保證藥效，各種藥液均在實驗前1 h內(nèi)配制)。實時記錄并分析自發(fā)慢反應電位的變化。實驗分組如下:(1)0.1 μmol/L、1 μmol/L+10 μmol/L胺碘酮對左心室流出道自發(fā)慢反應電位的影響(n=8);(2)1 μmol/L胺碘酮對低O2電生理效應的影響(n=8);(3)1 μmol/L胺碘酮對酸中毒電生理效應的影響(n=8);(4)1 μmol/L胺碘酮對10 μmol/L EPI電生理效應的影響(n=8)。

5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示，給藥前后各項指標采用自身配對t檢驗。

結果

1 胺碘酮對豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應電位的影響

0.1 μmol/L胺碘酮灌流豚鼠左心室流出道標本10 min，MDP絕對值明顯減小(P＜0.05)，APD80明顯延長(P＜0.05)，RPF明顯減慢，和正常對照組相比有顯著差異(P＜0.05)，見表1、圖1。

1 μmol/L胺碘酮灌流豚鼠左心室流出道標本10 min，3 min時MDP絕對值和APA開始減小，7 min時明顯減小，并維持在此水平，與正常對照組相比有顯著差異(MDP，P＜0.01;APA，P＜0.05);Vmax1 min時開始減慢，5 min時明顯減慢(P＜0.05)，并維持相對穩(wěn)定;APD50和APD80在給藥1 min時開始延長，3 min時明顯延長，和正常對照組相比，差異顯著(APD50，P＜0.05;APD80，P＜0.01);VDD和RPF在給藥當時即開始減慢，3 min時明顯減慢(VDD，P＜0.05;RPF，P＜0.01)。在10 min的灌流過程中，RPF有時不穩(wěn)定，可出現(xiàn)短暫的節(jié)律不齊現(xiàn)象，見表1、圖1。

10 μmol/L胺碘酮灌流10 min，MDP絕對值和APA明顯減小(P＜0.01)，Vmax明顯減慢(P＜0.05)，APD50(P＜0.05)和APD80(P＜0.01)明顯延長，VDD和RPF進一步減慢(P＜0.01)。10 μmol/L胺碘酮灌流過程中，節(jié)律不齊現(xiàn)象較頻繁。沖洗30 min，VDD和RPF均不能恢復到給藥前水平，說明胺碘酮的作用持續(xù)時間較長，見表1、圖1。

表1 胺碘酮對豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應電位的影響Table 1.Effects of amiodarone on the spontaneous action potentials of guinea pig left ventricular outflow tract(ˉx±s.n=8)

Figure 1.Effects of amiodarone on the spontaneous action potentials of guinea pig left ventricular outflow tract.圖1 胺碘酮對豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應電位的影響

2 1μmol/L胺碘酮對低O2電生理效應的影響

用無糖低O2液灌流15 min，MDP絕對值、APA和Vmax顯著降低(P＜0.05)，APD50顯著縮短(P＜0.05)，APD80有縮短趨勢，但無顯著差異;VDD和RPF在無糖低O2液灌流1 min時開始有所加快，出現(xiàn)一過性節(jié)律增快現(xiàn)象，但隨著灌流時間延長，VDD和RPF逐漸減慢，15 min時明顯減慢，和正常對照組相比，有顯著差異(P＜0.05)。在此基礎上改用1 μmol/L胺碘酮+無糖低O2液灌流10 min，3 min時MDP絕對值開始增大，7 min時和無糖低O2液灌流組相比明顯增大，并維持相對穩(wěn)定(P＜0.05)，APA進一步降低，但和無糖低O2液灌流組相比無顯著差異，Vmax明顯減慢(P＜0.05)，APD50和APD80明顯延長(APD50，P＜0.01;APD80，P＜0.05);VDD和RPF在1 μmol/L胺碘酮+無糖低O2液灌流1 min時進一步減慢，10 min時明顯減慢，和無糖低O2液灌流組相比，有顯著差異(VDD，P＜0.01;RPF，P＜0.05)。而且在1 μmol/L胺碘酮+無糖低O2液灌流過程中，自發(fā)節(jié)律較穩(wěn)定，見表2、圖2A。

3 1μmol/L胺碘酮對酸中毒電生理效應的影響

配制O2飽和的改良Locke液，調(diào)節(jié)pH為6.8，造成酸中毒的灌流液，此值是在心肌缺血、梗死的局部內(nèi)環(huán)境中常見的。在10min的灌流過程中，MDP絕對值有增大趨勢，但無顯著差異;APA在灌流3 min開始減小，5 min時明顯減小，和正常對照組相比，有顯著差異(P＜0.05)，Vmax2 min時開始加快，5 min時明顯加快(P＜0.01)，APD50有縮短趨勢，但無顯著差異，APD803 min時明顯縮短(P＜0.05)，VDD和RPF在灌流1 min時有所加快，但無顯著差異，5 min后即開始減慢，10 min時明顯減慢，和正常對照組相比，有顯著差異(P＜0.05)。在此基礎上，改用pH 6.8的1 μmol/L胺碘酮灌流左心室流出道標本10 min，MDP絕對值、APA明顯降低，和pH 6.8灌流組相比，有顯著差異(P＜0.05);Vmax有減慢趨勢，但無顯著差異;APD50和APD80明顯延長(APD50，P＜0.01;APD80，P＜0.05)，VDD和RPF在灌流1 min時進一步減慢，5min時明顯減慢，和pH 6.8灌流組相比，有顯著差異(VDD，P＜0.01;RPF，P＜0.05)，并在隨后的灌流過程中，一直維持在此水平，見表2、圖2B。

4 1μmol/L胺碘酮對10 μmol/L EPI電生理效應的影響

用10 μmol/L EPI灌流10 min，MDP絕對值(P＜0.05)和APA(P＜0.01)明顯增大，Vmax加快(P＜0.01)，APD50和APD80明顯縮短(P＜0.05)，VDD和RPF在給藥30 s即開始增快，3 min時明顯增快(P＜0.05)，并維持在此水平。用10 μmol/L EPI灌流10 min，此時自發(fā)慢反應電位各項指標已有明顯改變且保持相對穩(wěn)定，改用1 μmol/L胺碘酮+10 μmol/L EPI灌流，APA和MDP絕對值在灌流5 min時開始降低，10 min時明顯降低，和10 μmol/L EPI灌流組相比，有顯著差異(P＜0.05);Vmax3 min時開始減慢，10 min時明顯減慢(P＜0.05);APD50和APD801 min時開始延長，3 min時明顯延長(APD50，P＜0.05;APD80，P＜0.01)，并維持相對穩(wěn)定。VDD和RPF 3 min時開始減慢，10 min時明顯減慢，和10 μmol/L EPI灌流組相比，有顯著差異(P＜0.05)。在1 μmol/L胺碘酮+10 μmol/L EPI灌流過程中，節(jié)律較穩(wěn)定，見表2、圖2C。

Figure 2.Effects of amiodarone on the spontaneous action potentials of guinea pig left ventricular outflow tract induced by hypoxia，acidosis and EPI.A:effects of amiodarone(1 μmol/L)on hypoxia;B:effects of amiodarone(1 μmol/L)on acidosis(pH6.8);C:effects of amiodarone(1 μmol/L)on EPI(10 μmol/L).圖2 胺碘酮對低O2、酸中毒及EPI所致豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應電位改變的影響

表2 胺碘酮對低氧、酸中毒、EPI所致豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應電位改變的影響Table 2.Effects of amiodarone on the spontaneous action potentials of guinea pig left ventricular outflow tract induced by hypoxia，acidosis and EPI(ˉx±s.n=8)

討論

近年來眾多的臨床資料表明，一些過去一直無法解釋和診斷的特發(fā)性室顫、早搏、心動過速等心律失常往往是由右心室流出道形態(tài)異常和功能障礙所致。本室以前的工作在國內(nèi)外首次證明，在豚鼠、家兔、大鼠等左心室流出道部位仍存在慢反應自律細胞，且具有與竇房結起搏細胞相似的特征和離子流基礎，即0期主要離子流為ICa－L，3期主要離子流為Ik，4期自動去極中，除Ik的進行性衰減外，還有ICa－L、ICa－T和If的參與［3］。而且其電活動可能受自主神經(jīng)的調(diào)控，其中主要受心交感神經(jīng)及體液中CA的調(diào)節(jié)［4］。說明自主神經(jīng)功能紊亂或CA分泌異常在源于心室流出道心律失常的發(fā)生機制中也起一定作用。

廣譜抗心律失常藥胺碘酮是目前預防心房纖顫和維持竇性心律最有效且安全的藥物。周琳等［5］的研究表明胺碘酮可明顯抑制正常心肌細胞ICa－L，對正常及肥厚心肌細胞的Ik均有明顯的抑制作用。周彤等［6］也證實胺碘酮可明顯抑制ICa－L，且具有濃度依賴性。Yamashita等［7］的研究表明，胺碘酮對ICa－T也有一定的阻滯作用。本實驗中用胺碘酮灌流左心室流出道標本，VDD和RPF減慢，Vmax減慢，APA減小，可能與胺碘酮的ICa－L和ICa－T阻滯有關。APD50和APD80的延長為胺碘酮阻滯Ik所致。MDP絕對值減小可能為Ik的阻滯導致Ik進行性衰減加速，最大復極電位尚未恢復到正常水平即發(fā)生了緩慢自動去極化。胺碘酮的效應表現(xiàn)為濃度依賴性，隨著濃度的增加，各項指標的改變越明顯。用胺碘酮灌流左心室流出道標本10 min，在隨后的沖洗過程中，自發(fā)節(jié)律很難恢復到給藥前水平，與文獻報道一致［7］。

低氧和酸中毒對心肌細胞電生理特性的影響與多種離子流有關。自1983年Noma發(fā)現(xiàn)了IKATP以來，該通道在心肌缺血或低氧時的作用引起了電生理學者的極大關注。一般情況下，心肌細胞的KATP活性很低，只有在心肌缺氧，能量耗竭時才被大量激活。祝芬等［8］記錄到低氧時外向電流峰值明顯升高，該電流可被IKATP特異性阻斷劑優(yōu)降糖完全阻斷，證明此電流是ATP敏感性鉀電流。徐巖等［9］也證實急性低氧時，IKATP明顯增加，同時伴有不同程度ICa－L抑制。Grover［10］報道，心肌缺氧時KATP被激活后，抑制電壓依賴性鈣通道。KATP通道還對細胞內(nèi)外的酸堿度敏感。代謝產(chǎn)物(尤其是酸性代謝產(chǎn)物)堆積，pH下降可引起該通道的開放，促進K+外流［11］。同時抑制電壓依賴性鈣通道的激活，使Ca2+內(nèi)流減少。本實驗中用無糖低氧液和pH 6.8的灌流液灌流時，VDD和RPF減慢，APA減小，Vmax減慢，可能與ICa－L的抑制有關，APD50和APD80縮短與IKATP的開放密切相關。無糖低氧液灌流時MDP絕對值減小，原因可能為KATP開放導致細胞外K+積聚，阻礙K+進一步外流。胺碘酮可使低O2和酸中毒導致的VDD和RPF減慢進一步加重，可能為胺碘酮明顯抑制Ik和ICa－L所致。黃冬等［12］的研究也證實胺碘酮對模擬缺氧狀態(tài)下大鼠心室肌細胞的Ik1電流有明顯的抑制作用。

體液中的兒茶酚胺可作用于心肌細胞膜上的β1腎上腺素能受體(β1－AR)，進而增加L型鈣流(ICa－L)和4期內(nèi)向電流(If)［13］。故本實驗中用10 μmol/L EPI灌流時可表現(xiàn)為VDD和RPF明顯加快，APA增大，Vmax加速，APD50和APD80縮短。MDP絕對值增大，可能是由于CA具有刺激生電性鈉泵的作用之故［13］。而采用1 μmol/L胺碘酮+10 μmol/L EPI灌流時，由EPI所致的各項指標的改變可逐漸恢復，說明胺碘酮可能具有對抗自主神經(jīng)功能紊亂或體液中CA異常所致的源于心室流出道心律失常的作用。

［1］陳彥靜，葛賦貴.豚鼠主動脈前庭組織的自律性研究和形態(tài)學觀察［J］.生理學報，1994，46(5):458－464.

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［7］Yamashita N，Kaku T，Uchino T，et al.Short－and long－term amiodarone treatments regulate Cav3.2 low－voltage activated T－type Ca2+channel through distinct mechanisms［J］.Mol Pharmacol，2006，69(5):1684－1691.

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［13］姚泰.人體生理學［M］.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001.1148－1151.

Electrophysiological effects of amiodarone on pacemaker cells in guineapig left ventricular outflow tract under conditions of hypoxia，acidosis and treatment with epinephrine

ZHAO Lan－ping1，WANG Xue－fang1，CHEN Yan－jing1，DU Hui－bo1，HU Xingguang1，JI Zhen－h(huán)ui2
(1Department of Physiology，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China;2The Hospital of Hebei Normal University，Shijiazhuang 050091，China.E－mail:zhaolp－doc@tom.com)

AIM:To study the electrophysiological effects of amiodarone on the pacemaker cells in guinea－pig left ventricular outflow tract under the conditions of hypoxia，acidosis and treatment with epinephrine.METHODS:The action potentials of the pacemaker cells in guinea－pig left ventricular outflow tract were recorded by conventional intracellular microelectrode technique.The effects of amiodarone on the spontaneous slow response potentials were investigated under the conditions of hypoxia，acidosis and treatment with epinephrine.RESULTS:(1)Amiodarone at concentration of 0.1 μmol/L markedly decreased the rate of pacemaker firing(RPF)and maximal diastolic potential(MDP)，lengthened 80%of the duration of action potential(APD80).Amiodarone at concentration of 1 μmol/L significantly decreased the velocity of diastolic depolarization(VDD)and RPF，the maximal rate of depolarization(Vmax)，MDP and amplitude of action potential(APA)，lengthened 50%of the duration of action potential(APD50)and APD80.Amiodarone at concentration of10 μmol/L led to a significant decrease in VDD and RPF，Vmax，MDP and APA，a notable lengthening in APD50and APD80was also observed.(2)Under the condition of hypoxia and perfusion with deprived glucose content for 15 min，VDD，RPF，MDP，Vmaxand APA decreased significantly，APD50was shortened notably.Under the condition of hypoxia，amiodarone at concentration of 1 μmol/L significantly decreased VDD，RPF and Vmax，increased MDP，lengthened APD50and APD80as compared to the cells treated with hypoxia only.(3)Perfusion with pH 6.8 solution for 10 min，VDD and RPF significantly decreased，Vmaxand APA notably reduced，APD80was markedly shortened.Under the condition of acidosis for 10 min，amiodarone significantly decreased VDD，RPF，MDP and APA，lengthened APD50and APD80as compared to the cells under the condition of acidosis only.(4)Perfusion of epinephrine at concentration of 10 μmol/L for 10 min resulted in a significant increase in VDD，RPF，Vmax，MDP and APA，a notable shorting in APD50and APD80was also observed.Compared to 10 μmol/L epinephrine group，1 μmol/L amiodarone+10 μmol/L epinephrine significantly reduced VDD，RPF，Vmax，MDP and APA，lengthened APD50and APD80.CONCLUSION:Amiodarone markedly decreases the autorhythmicity of the pacemaker cells in guinea－pig left ventricular outflow tract.This electrophysiological effects were significantly influenced by hypoxia，acidosis and epinephrine.

Amiodarone;Hypoxia;Acidosis;Epinephrine;Left ventricular outflow tract;Autorhythmic cell

Q463;R331.3

A

10.3969 /j.issn.1000－4718.2010.07.010

1000-4718(2010) 07-1295-06

2009－12－16

2010－04－22

河北省科技廳科學技術研究與發(fā)展計劃資助項目(No.062761880)

△通訊作者Tel:0313－4029313;E－mail:zhaolp－doc@tom.com