曹衛(wèi)平， 錢(qián)秋菊， 溫 堅(jiān)， 陳 霽， 汪科換， 邵春梅

(1鎮(zhèn)江市婦幼保健院，江蘇鎮(zhèn)江212001;2鎮(zhèn)江市潤(rùn)州區(qū)人民醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江212000)

妊娠期高血壓疾病是妊娠期特有的疾病，嚴(yán)重威脅母嬰安全，是孕婦和圍產(chǎn)兒發(fā)病和死亡主要原因之一。其發(fā)病率高達(dá)7%－10%，但確切原因和發(fā)病機(jī)制至今尚不十分清楚?，F(xiàn)代生殖免疫學(xué)研究證明，正常妊娠的維持有賴于母胎免疫耐受的形成，一旦免疫耐受機(jī)制失衡，將導(dǎo)致病理性妊娠如流產(chǎn)、妊娠期高血壓疾病等發(fā)生。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在外周免疫耐受、移植免疫耐受以及母體對(duì)胎兒的耐受方面起著重要作用［1］。轉(zhuǎn)錄因子Forkhead box p3、Foxp3是CD4+CD25+Treg細(xì)胞發(fā)育和功能維持的重要調(diào)節(jié)基因［2］。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色和定量PCR的方法，分別從蛋白質(zhì)和 mRNA水平檢測(cè)Foxp3+的表達(dá)，以探討CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在妊娠期高血壓疾病發(fā)病中作用。

材料和方法

1 材料

1．1 主要試劑 異硫氰酸酯(flioresceine isothiocyanate，F(xiàn)ITC)熒光標(biāo)記抗人CD4、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的抗人CD25以及藻紅蛋白－青色素染料5(phycoerythrincyanine Dye5，PE－Cy5)標(biāo)記的抗人Foxp3試劑盒(含配套的固定和透膜劑)均購(gòu)自eBioscience;淋巴細(xì)胞分離液(上海試劑二廠)，RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen);逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR試劑盒(TaKaRa)。

1．2 研究對(duì)象及分組 選擇2007年11月至2008年6月在鎮(zhèn)江市婦幼保健院、鎮(zhèn)江市潤(rùn)州區(qū)人民醫(yī)院門(mén)診及住院的56例妊娠期高血壓疾病患者。其中妊娠期高血壓疾病20例，輕度子癇前期16例、重度子癇前期20例。年齡平均為(30.2±4.8)歲，孕周平均為(35.6±3.2)周;選擇同期正常孕婦20例，年齡平均為(31.4±5.2)歲，孕周平均為(37.2±1.4)周。正常育齡婦女16例，年齡平均為(29.2±5.8)歲。年齡比較差異無(wú)顯著。2組孕婦孕周比較無(wú)顯著差異。妊娠期高血壓疾病的診斷參考樂(lè)杰主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》(第6版)中的標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法

2．1 標(biāo)本采集 各組研究對(duì)象抽取靜脈血4 mL，乙二胺四乙酸二鈉(ethylene diamine tetraucetie acid disodium salt，Na2EDTA)抗凝，采用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，以PBS洗滌后重懸備用。

2．2 細(xì)胞表面及胞內(nèi)染色以及檢測(cè) 細(xì)胞染色的順序是先進(jìn)行細(xì)胞表面分子CD4及CD25的染色，然后經(jīng)過(guò)固定、透膜后再染細(xì)胞內(nèi)的Foxp3的分子。簡(jiǎn)要概括如下:取細(xì)胞懸液100μL，加20μL CD4FITC和CD25－PE混合抗體，避光4℃孵育30 min，冷PBS洗滌后再加入1 mL經(jīng)過(guò)稀釋的固定、透膜劑反應(yīng)60 min后以透膜緩沖液洗滌并重懸，再加入20μL PE－Cy5標(biāo)記的抗人Foxp3抗體(同時(shí)設(shè)同型對(duì)照反應(yīng)管)，反應(yīng)30 min后洗滌，以400μL冷PBS重懸，采用BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用CellQuest軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2．3 總RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 采用Trizo1試劑提取外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA，取總RNA 2μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。

2．4 定量PCR檢測(cè)Foxp3mRNA表達(dá) 取上述cDNA，采用TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，總體積為20μL，按試劑說(shuō)明書(shū)操作。引物由上海生工合成，F(xiàn)oxp3:5’－TTTCTGTCAGTCCACTTCACCA －3’和 5’－CCAGCAGGTCTGAGGCTTTG－3’;β－actin:5’－TGGCACCCAGCACAATGAA－3’和 5’－TAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA－3’。Foxp3的表達(dá)水平以其與內(nèi)參照β－actin的比值表示，所用定量PCR儀型號(hào)為羅氏Lightcycler。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Stata 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)和方差分析。

結(jié) 果

1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)妊娠期高血壓疾病患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞比例改變

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)雙標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)妊娠期高血壓疾病患者外周血CD4+T細(xì)胞CD25分子的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常育齡婦女相比，正常妊娠婦女外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞所占比例明顯增加(P＜0.05)，妊娠期高血壓患者呈下降趨勢(shì)，但差異無(wú)顯著(P＞0.05)，而子癇前期患者明顯減少(P＜0.01);與正常妊娠婦女比較，妊娠期高血壓組CD4+CD25+T細(xì)胞所占比例有減少的趨勢(shì)，但差異無(wú)顯著(P＞0.05)，子癇前期(包括輕度與重度)CD4+CD25+T細(xì)胞所占比例明顯減少(P＜0.01)，而且重度子癇前期的比例明顯低于妊娠高血壓患者(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)妊娠期高血壓疾病患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞Table 1．Detection of CD4+CD25+T cells in peripheral blood of patients with gestational hypertension by flow cytometry(%．ˉx±s)

2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)妊娠期高血壓疾病患者外周血CD4+CD25+Foxp3比例變化

與正常育齡婦女相比，正常妊娠婦女外周血中CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所占比例明顯增加(P＜0.05)，而妊娠期高血壓、輕度子癇前期和重度子癇前期患者CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所占比例明顯低于正常育齡(P＜0.05)和正常妊娠婦女(P＜0.01)。另外，輕度子癇前期和重度子癇前期患者CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所占比例明顯低于妊娠期高血壓(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

3 定量PCR檢測(cè)妊娠期高血壓疾病患者外周血Foxp3 mRNA表達(dá)

為進(jìn)一步驗(yàn)證流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的結(jié)果，采用定量PCR的方法檢測(cè)了Foxp3 mRNA表達(dá)水平，所得結(jié)果與蛋白質(zhì)表達(dá)水平相一致，見(jiàn)圖2。

討 論

近年來(lái)，一些具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞(Treg)引起了研究者的廣泛關(guān)注。胸腺來(lái)源的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，約占人外周血CD4+T細(xì)胞的5% －10%，是最重要的Treg細(xì)胞亞群之一，其主要的功能有維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、抑制機(jī)體對(duì)同種異體移植物的排斥反應(yīng)以及影響其它T細(xì)胞的功能等。CD4+CD25+Treg對(duì)人類妊娠有著重要的影響［1］。研究發(fā)現(xiàn)妊娠早期直至分娩后短暫時(shí)期，循環(huán)系統(tǒng)中Treg細(xì)胞顯著增加。體外研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+T細(xì)胞對(duì)母體自身有抑制效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，正常妊娠婦女外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞所占比例明顯增加，妊娠期高血壓組CD4+CD25+T細(xì)胞所占比例有減少的趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異，而子癇前期(包括輕度與重度)CD4+CD25+T細(xì)胞所占比例明顯減少。Sasaki等［3］也報(bào)道子癇前期患者外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞明顯低于正常妊娠和正常育齡婦女，該結(jié)果與本研究結(jié)果相一致，提示這群調(diào)節(jié)性細(xì)胞可能參與了妊娠期高血壓疾病發(fā)病。

Foxp3是一種轉(zhuǎn)錄因子，定位于細(xì)胞內(nèi)，是CD4+CD25+T細(xì)胞分化發(fā)育和功能維持的一個(gè)重要調(diào)控基因。目前已證實(shí)Foxp3的mRNA及其編碼蛋白Scurfin只特異性地表達(dá)于CD4+CD25+T細(xì)胞。雖然大部分CD4+CD25+T細(xì)胞產(chǎn)生于胸腺，但胸腺內(nèi)Foxp3過(guò)度表達(dá)卻不能阻止缺失功能性Foxp3基因小鼠疾病的發(fā)生，說(shuō)明Foxp3在外周CD4+T細(xì)胞具有重要的功能。本研究發(fā)現(xiàn)Foxp3水平在各組間變化一致，即CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在正常妊娠時(shí)顯著增加，而妊娠期高血壓疾病患者，隨著疾病進(jìn)展，CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，逐漸下降，至重度子癇前期，下降尤為顯著［4］，同時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果也證明與蛋白質(zhì)結(jié)果相一致，這些結(jié)果表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能參與了妊娠期高血壓疾病的病理進(jìn)程。外周血CD4+T細(xì)胞Foxp3表達(dá)降低，說(shuō)明真正發(fā)揮抑制功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量降低。而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的減少可能使妊娠期高血壓疾病患者機(jī)體內(nèi)負(fù)向調(diào)控機(jī)制發(fā)生紊亂，產(chǎn)生針對(duì)自身抗原成分的效應(yīng)細(xì)胞及分子，打破了機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，從而引起母體免疫損傷，使胚胎易遭受免疫攻擊而被母體排斥。

Figure 1．Flow cytometric analysis of the expression of the transcription factor Foxp3．A:the proportion of Foxp3．ˉx±s．n=36(n=16 mild preeclampsia;n=20 severe preeclampsia)．*P＜0.05 vs normal pregnancy group;#P＜0.05 vs non－pregnancy group;◆P＜0.05 vs hypertensive disorder complicating pregnancy(HDCP)group．B:plots for Foxp3 vs CD25 expression of gated CD4+T cells，the Foxp3 positive cells were quantitated for the CD25+populations．PE:preeclampsia．圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)妊娠期高血壓疾病患者CD4+CD25+Foxp3+比例變化

Figure 2．Analysis of Foxp3 expressing level in gestational hypertension patients of peripheral blood by using realtime PCR．ˉx±s．n=36(n=16 mild preeclampsia;n=20 severe preeclampsia)．*P ＜ 0.05 vs normal pregnancy group;#P＜0.05 vs non－pregnancy group;◆P＜0.05 vs hypertensive disorder complicating pregnancy(HDCP)group．PE:preeclampsia．圖2 定量PCR檢測(cè)妊娠期高血壓疾病患者外周血Foxp3mRNA表達(dá)

本研究從蛋白質(zhì)和mRNA水平證明了CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在妊娠期高血壓疾病進(jìn)程中表達(dá)異常，進(jìn)一步深入研究CD4+CD25+Foxp3在妊娠期高血壓疾病中作用，有望從蛋白質(zhì)和mRNA水平找到新的干預(yù)靶點(diǎn)，從而通過(guò)使用主動(dòng)免疫治療為妊娠期高血壓疾病的診治提供新途徑。

［1］ 陳莉娟，周 浩，朱劍文，等．Foxp3轉(zhuǎn)染CD4+CD25－T細(xì)胞抑制 NK細(xì)胞活性［J］．中國(guó)病理生理雜志，2009，25(6):1151－1155．

［2］ Zheng Y，Rudensky AY．Foxp3 in control of regulatory T cell lineage［J］．Nat Immunol，2007，8(5):457 －462．

［3］ Sasaki Y，Darmochwakl－Kolarz D，Suzuki D，et al．Proportion of peripheral blood and decidual CD4+CD25+regulatory T cells in pre － eclampsis［J］．Clin Exp Immunol，2007，149(1):139－145．

［4］ Wilczvnski JR．Immunological analogy between allograft rejection，recurrent abortion and preeclampsia the same basic mechanism? ［J］．Hun Immunol，2006，67(7):492－511．