黃永紅，徐方云△，王紅梅，徐優(yōu)慧，溫淦升

(1南昌大學醫(yī)學院病理生理學教研室，2江西中醫(yī)學院，江西 南昌 330006)

p53基因是腫瘤抑制基因的一種，其表達的正常蛋白少量存在于胞核內(nèi)。p53基因突變存在于大約50%以上的人類各種惡性腫瘤中[1，2]。p53基因的突變通常會導致腫瘤細胞中P53蛋白的過度表達。來源于過度表達P53蛋白的肽可由主要組織相容性抗原(major histocompatibility antigen，MHC)Ⅰ類分子提呈，于腫瘤相關(guān)表位發(fā)揮作用，誘導產(chǎn)生P53特異性的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)反應(yīng);一系列實驗表明10%-20%的人類腫瘤患者血清中均存在抗P53抗體[3]。說明機體存在針對P53的B細胞和T細胞免疫反應(yīng)。因此，P53蛋白可以作為腫瘤抗原成為腫瘤免疫治療的靶標。本研究采用p53基因修飾小鼠宮頸癌U14細胞，觀察經(jīng)p53修飾U14細胞瘤苗能否增強小鼠脾細胞對U14細胞的細胞毒作用，為進一步探討宮頸癌的疫苗治療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 昆明種(Kunming，Km)處女鼠，5-6周齡，體重18-22 g，南昌大學醫(yī)學院動科部提供。實驗期間，全價營養(yǎng)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 腫瘤細胞 小鼠宮頸癌U14細胞株，U14細胞系Km小鼠異位誘發(fā)的可移植性宮頸未分化鱗狀細胞癌。在本研究室采取細胞懸液Km小鼠腹腔接種已傳代多年。

1.3 主要試劑 質(zhì)粒pC53-SN3、陽離子脂質(zhì)體Lipofectin均為本教研室貯存產(chǎn)品;四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、λDNA/HindⅢ購自華美生物工程公司;小牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所;G418購自北京博大泰克生物基因;RPMI-1640干粉培養(yǎng)基購自Gibco;小鼠抗人P53單抗(sc-126)購自北京中杉生物試劑公司;辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標記羊抗小鼠IgG購自華美生物工程公司。

2 方法

2.1 質(zhì)粒的提取純化及鑒定 將含pC53-SN3質(zhì)粒的大腸桿菌進行擴增，參照質(zhì)粒提取純化試劑盒說明進行提取純化質(zhì)粒，再用HindⅢ酶切、電泳鑒定。

2.2 p53基因的轉(zhuǎn)染和篩選 收集處于對數(shù)生長期的U14細胞，將其分為U14細胞對照組和p53-U14細胞組。基因轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染方法及篩選步驟見參考文獻[4]。

2.3 轉(zhuǎn)染克隆的鑒定 采用鏈霉菌親生物素蛋白-過氧化物酶連接法(streptavidin peroxidlase coiliugateti method，SP法)檢測抗性細胞中P53蛋白的表達，設(shè)立未轉(zhuǎn)染細胞組和空白對照組。

2.4 細胞瘤苗的制備 用磷酸緩沖溶液(phosphate buffer solution，PBS)(pH7.2)將p53-U14細胞和U14細胞濃度調(diào)整為1×1011cells/L，然后細胞經(jīng)-80℃/37℃條件下反復凍融4次，將凍融物于4000 r/min離心5 min，收集上清于13000 r/min離心60 min，再將上清經(jīng)濾膜過濾除菌，分裝，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 細胞毒作用的測定 制備效應(yīng)細胞懸液:取9只Km處女鼠，隨機分成3組即:p53-U14細胞瘤苗組、U14細胞瘤苗組、空白對照組，每組3只動物，分別腹腔注射p53-U14細胞瘤苗、U14細胞瘤苗和PBS各0.2 mL(細胞總數(shù)為2×107cells/mouse)進行免疫，間隔7 d，再同法免疫1次，7 d后將各動物頸椎脫臼處死。無菌條件下取脾臟，用眼科剪將其剪碎，用注射器針芯輕輕壓磨剪碎的脾臟后過200目濾網(wǎng)。PBS漂洗1次，Tris/NH4Cl處理5 min去紅細胞，再用PBS漂洗3次，臺盼藍拒染實驗確定細胞活力(＞95%)，重懸于含10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞濃度為5×109cells/L。制備靶細胞懸液:將U14細胞重懸于含10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞濃度1×109cells/L。實驗分3組:p53-U14細胞瘤苗組、U14細胞瘤苗組和空白對照組(PBS組)。在96孔細胞培養(yǎng)板中各孔按效靶比20∶1和40∶1分別加入效應(yīng)細胞和靶細胞，每孔設(shè)3個平行孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h。實驗終止前4 h，加入MTT 10 μL/well繼續(xù)培養(yǎng)4 h后;用10%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)-0.01 mol/L HCl溶液100 μL/well振蕩器上振蕩至顆粒完全溶解。過夜，酶標儀測570 nm波長處吸光度(absorbance，A)值，求出3孔A值平均值。按下列公式計算各組細胞殺傷率:

殺傷率=[1-(實驗孔A均值-效應(yīng)細胞孔A均值)/靶細胞孔A均值]×100%。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 p53質(zhì)粒的鑒定及基因轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)染克隆的篩選

將提取的質(zhì)粒DNA進行酶切檢測。pC53-SN3用核酸限制性內(nèi)切酶HindⅢ切割，設(shè)立未用HindⅢ酶切的pC53-SN3作為對照。酶切產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠電泳，電泳完畢后于紫外檢測儀下觀測，可見相應(yīng)條帶出現(xiàn)，顯示所提取的質(zhì)粒DNA大小正常，含p53質(zhì)粒DNA。轉(zhuǎn)染后72 h用選擇性培養(yǎng)基進行篩選，篩選后10 d，未轉(zhuǎn)染細胞全部死亡，維持選擇培養(yǎng)4周，可見抗G418克隆出現(xiàn)，取少量抗性細胞到新培養(yǎng)瓶進行擴大培養(yǎng)，命名為p53-U14細胞。

2 抗性細胞基因表達的檢測

p53-U14細胞組可見P53表達，主要表現(xiàn)為胞核著棕黃色，染色深淺不一，有部分細胞可見很深的黃染，而U14細胞組和陰性對照組細胞胞核未見著棕黃色。

3 細胞毒作用的測定

MTT比色法檢測表明，p53-U14細胞瘤苗組脾細胞殺傷活性最高，U14細胞瘤苗組脾細胞殺傷活性次之，空白對照組最低，見表1。經(jīng)統(tǒng)計學分析，在效靶比為20∶1和40∶1時，各組與p53-U14細胞組比較有極顯著差異(P＜0.01)。

表1 MTT法測定不同效靶比時效應(yīng)細胞殺傷活性Table1.The cytotoxicity of effector cells at the different ratios by MTT(.n=3)

表1 MTT法測定不同效靶比時效應(yīng)細胞殺傷活性Table1.The cytotoxicity of effector cells at the different ratios by MTT(.n=3)

＊＊P ＜0.01 vs p53-U14 group.

Group Cytotoxic rate(%)20∶1 40∶1 p53-U14 64.91±1.54 58.87±1.87 U14 42.14 ±0.84＊＊ 42.91 ±0.11＊＊PBS 21.66±0.22＊＊ 8.19±0.14＊＊

討 論

大量研究證實，腫瘤免疫的中心問題是腫瘤抗原問題。腫瘤抗原肽曾被認為是最有希望的瘤苗，但實踐證明，它并不一定能激發(fā)機體抗腫瘤免疫應(yīng)答。原其因可能是多方面的，其中一個重要原因在于腫瘤細胞可表達多種腫瘤抗原，針對某個或某些表位產(chǎn)生的免疫應(yīng)答不能有效抑制腫瘤細胞的生長。全細胞瘤苗可表達多種腫瘤抗原，故不失為一種好方法。但由于腫瘤細胞本身免疫原性相對較弱，因此對其進行修飾增強其免疫原性成為腫瘤免疫治療的一種新途徑。許多研究表明[5]，腫瘤細胞中P53蛋白的表達較正常細胞明顯上調(diào)，因此認為P53抗原是一種腫瘤相關(guān)抗原，可以成為免疫系統(tǒng)識別的靶標。使用突變和野生P53抗原肽進行免疫以及過繼性轉(zhuǎn)移野生P53特異性T細胞均可使腫瘤消退[6-9]。

在本實驗研究中采用全長野生型P53基因?qū)δ[瘤細胞瘤苗進行修飾，瘤苗通過腹腔途徑多次免疫小鼠，經(jīng)MTT比色法證實經(jīng)該細胞瘤苗免疫后的小鼠脾細胞能更有效地殺傷相應(yīng)的腫瘤細胞。

對于P53抗原如何誘導免疫應(yīng)答的問題，目前認為由于P53蛋白是細胞內(nèi)蛋白，主要通過MHC-Ⅰ類分子途徑進行提呈。P53抗原在胞漿內(nèi)被蛋白酶體降解為短肽，通過抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白(transporters associated with antigen processing，TAP)轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，具有特定基序結(jié)構(gòu)的肽段和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的MHC-Ⅰ類分子結(jié)合，經(jīng)高爾基體提呈于腫瘤細胞表面。在提呈過程中，蛋白酶體對腫瘤抗原的降解以及TAP對抗原肽的轉(zhuǎn)運均有利于MHC-Ⅰ類分子與抗原肽的結(jié)合。含有LMP2和LMP7活性單位的蛋白酶體有選擇地在疏水性或堿性氨基酸殘基下游肽鍵對腫瘤抗原進行切割，切割出8-10個氨基酸肽段，TAP選擇性地轉(zhuǎn)運8-10個氨基酸的抗原肽段，這種長度正是MHC-Ⅰ類分子肽結(jié)合槽所能容納的最適長度。提呈于腫瘤細胞表面的腫瘤抗原肽/MHC-Ⅰ類復合物與T細胞受體(T-cell receptor，TCR)互補結(jié)合，提供初始(na?ve)CD8+T細胞活化所需的抗原識別信號。CD8+T細胞在識別P53抗原的同時獲得B7/CD28、CD40/CDL等共刺激分子提供的協(xié)同刺激信號才能活化，活化的CD8+T細胞增殖并分化為功能性CTL細胞還需CD4+T細胞分泌的IL-2的輔助，才可以達到最優(yōu)的免疫效能。

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