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        核黃素對STZ誘導的大鼠糖尿病腎病的治療作用

        2010-08-02 13:04:40王國光陸曉華
        中國病理生理雜志 2010年7期
        關鍵詞:糖尿病檢測

        王國光,張 翠,陸曉華,李 偉

        (皖南醫(yī)學院病理生理教研室,安徽 蕪湖 241000)

        糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病重要的并發(fā)癥之一,始于糖尿病發(fā)病之初,血糖達到糖尿病診斷標準后DN即開始[1],是危及病人生命的主要原因。DN早期的主要病理特征是腎小球肥大,腎小球和腎小管基底膜增厚及系膜區(qū)細胞外基質的進行性積聚;后期為腎小球、腎小管間質的纖維化,最終導致蛋白尿和腎功能衰竭。DN的發(fā)病機制較復雜,目前認為高血糖、氧化應激[2,4]、糖基化末端產(chǎn)物[3]、高胰島素和血脂異常等在DN的發(fā)生過程中起著非常重要的作用。越來越多的證據(jù)表明,糖尿病引起的氧化應激是導致糖尿病慢性并發(fā)癥的最根本原因之一[4,5]。因此,許多具有抗氧化作用及提高機體抗氧化能力的藥物被用于治療DN[6,7]。

        近年來,越來越多的研究證據(jù)表明轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)在 DN的發(fā)病機制中占有重要地位,TGF-β可能為DN發(fā)病機制的最后共同通路[8],在高血糖狀態(tài)下,有多種生化異常及微循環(huán)障礙共同參與DN的發(fā)生發(fā)展,包括蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的激活、蛋白非酶糖化作用、氧化應激、腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性增加等,它們可通過各種途徑參與TGF-β的調節(jié),導致細胞外基質(extracellular matrix,ECM)積聚及腎小球硬化。TGF-β1引起的纖溶酶原活化抑制因子-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)mRNA及蛋白的表達增加和纖維蛋白溶酶活性的降低,進而使ECM沉積增多。

        核黃素又稱維生素B,它是動物體內參與碳水化合物、蛋白質和脂肪代謝的許多酶的組成部分。并作為抗氧化維生素之一,在動物的抗氧化體系中起著重要作用[9,10]。本研究旨在探討核黃素對鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導的大鼠DN的保護作用,研究核黃素對TGF-β1和PAI-1表達的影響,初步研究核黃素對糖尿病大鼠腎臟的保護機制。

        材料和方法

        1 動物

        雄性 Sprague-Dawley大鼠36只,體重180-220 g,購自南京青龍山動物養(yǎng)殖場。

        2 主要試劑

        STZ購自 Sigma;兔抗鼠 TGF-β1、PAI-1多克隆抗體購自武漢Boster公司;硝酸纖維素膜、堿性磷酸酶標記的Ⅱ抗、葡萄糖檢測試劑盒等購自合肥博美生物公司;核黃素購自上海化學試劑采購供應站分裝廠;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、考馬斯亮藍法檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

        3 動物分組及模型的制備

        大鼠自由飲水、進食。將大鼠隨機分為3組:正常對照組(normal control,NC)、糖尿病模型組(diabetic model,DM)、核黃素治療組(DM+riboflavin,RB),每組10只。適應性喂養(yǎng)1周,禁食12 h,腹腔注射STZ 65 mg/kg(溶于0.1%pH4.5的無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液),正常對照組注射無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,48 h尾靜脈空腹采血測血糖,血糖值≥13.8 mmol/L的大鼠為糖尿病模型組。造模后分組喂養(yǎng),處理如下:正常對照組和模型組大鼠以正常飼料喂養(yǎng),核黃素組大鼠輔以核黃素喂養(yǎng),20 mg/d。各組實驗大鼠于8周后,大鼠處死前1 d代謝籠收集24 h尿液,記錄尿量,麻醉,頸動脈取血,分離血清,切取腎臟,用濾紙吸干后稱重,一側腎臟置-80℃冰箱保存供Western blotting檢測用,部分腎臟以10%中性甲醛固定,做病理檢查。

        4 組織形態(tài)學觀察

        腎組織標本經(jīng)10%中性甲醛溶液固定,常規(guī)梯度乙醇脫水,石蠟包埋,制成厚4 μm石蠟切片,行HE染色,在光鏡下觀察腎組織形態(tài)學改變。

        5 生化指標的檢測

        考馬斯亮藍法測尿蛋白。?。?0℃保存的各組腎皮質組織勻漿,測定SOD、CAT的活性及MDA的含量,測定血清SOD、CAT活性,測定均嚴格按照試劑盒說明書操作。

        6 Western blotting檢測

        取-80℃保存的各組腎皮質組織,勻漿、離心后,標定上清液蛋白濃度上樣,經(jīng)12%SDS-PAGE電泳分離,將目的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上,脫脂奶粉封閉,TBST沖洗后加兔抗鼠TGF-β1、PAI-1Ⅰ抗,4℃孵育過夜。TBST液沖洗,加堿性磷酸酶標記的Ⅱ抗孵育,洗膜后NBT/BCIP顯色。

        7 統(tǒng)計學處理

        結 果

        1 大鼠的一般狀況

        注射STZ誘導糖尿病后,大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿等典型的糖尿病表現(xiàn),相應的對照組大鼠食量、飲水、尿量及精神狀態(tài)基本正常,體重明顯增加。經(jīng)喂以核黃素,大鼠的飲水、食量和尿量有較明顯的改善。

        2 核黃素對尿蛋白及腎臟臟器系數(shù)的影響

        實驗結束時,檢測到糖尿病組大鼠24 h尿蛋白量明顯高于正常對照組(P<0.01),見表1,輔以核黃素喂養(yǎng)的糖尿病大鼠尿蛋白量較糖尿病組明顯減少(P<0.01),見表1。由表中1可見,糖尿病組大鼠體重下降,腎臟臟器系數(shù)增大,與正常組比較有顯著差異(P<0.01);核黃素治療組大鼠體重及腎臟臟器系數(shù)較糖尿病組均有所改善,腎臟臟器系數(shù)明顯降低(P<0.01)。

        表1 核黃素對尿蛋白及腎臟臟器系數(shù)的影響Table1.Effects of riboflavin on the content of protein in urine and the ratio of kidney and body weight(.n=10)

        表1 核黃素對尿蛋白及腎臟臟器系數(shù)的影響Table1.Effects of riboflavin on the content of protein in urine and the ratio of kidney and body weight(.n=10)

        ##P <0.01 vs normal control;**P <0.01 vs diabetic model.

        Group Urinary protein(mg) Kidney weight(g) Body weight(kg) KW/BW(mg/g)Normal control 5.75 ±1.81 2.21 ±0.37 405.50 ±21.64 5.45 ±0.91 Diabetic model(DM) 39.92 ±8.57## 2.17 ±0.34 168.38 ±16.61## 13.02 ±2.40##DM+riboflavin 19.92 ±4.77** 2.06 ±0.18 281.24 ±27.05** 7.39 ±0.97**

        3 各組大鼠血清SOD、CAT活性變化

        與正常對照組比較,糖尿病組大鼠血清的SOD、CAT活性明顯降低(P<0.01),見圖1,顯示大鼠的抗自由基能力下降;而核黃素治療組大鼠的SOD、CAT活性較糖尿病組有顯著提高(P<0.01),見圖1,表明大鼠機體的抗氧化能力有所提高。

        Figure1.Effects of riboflavin on the activities of SOD and CAT in serum.NC:normal control;DM:diabetic model;RB:DM+riboflavin..n=10.##P<0.01 vs NC;**P <0.01 vs DM.圖1 核黃素對血清SOD、CAT活性的影響

        4 腎組織的抗氧化酶活性變化

        糖尿病大鼠腎組織中抗氧化酶SOD、CAT活性較對照組明顯降低(P<0.01),見表2,與此相應,MDA含量明顯升高(P<0.01),見表2,表明組織抗氧化作用下降;核黃素組大鼠腎組織SOD、CAT活性較糖尿病組顯著提高,MDA含量明顯降低(P<0.01),見表2,顯示經(jīng)核黃素治療,糖尿病大鼠腎組織抗氧化作用有所改善。

        表2 核黃素對SOD、CAT活性及MDA含量的影響Table2.Effects of riboflavin on the activities of SOD,CAT,and the content of MDA in the kidney(.n=10)

        表2 核黃素對SOD、CAT活性及MDA含量的影響Table2.Effects of riboflavin on the activities of SOD,CAT,and the content of MDA in the kidney(.n=10)

        ##P <0.01 vs normal control;**P <0.01 vs diabetic model.

        SOD CAT MDA Group (U/g protein) (U/g protein) (mol/g protein)Normal control 2.36 ±0.44 11.94 ±1.14 306.5 ±39.8 Diabetic model(DM)0.38 ±0.07## 3.05 ±0.55## 637.9 ±76.1##DM+riboflavin 1.24 ±0.23** 5.86 ±1.08** 441.1 ±39.5**

        5 Western blotting檢測結果

        糖尿病組和核黃素治療組大鼠腎臟皮質都檢測到TGF-β1、PAI-1蛋白的表達,核黃素治療組大鼠腎皮質中TGF-β1和PAI-1的表達均明顯低于糖尿病模型組,見圖2。

        Figure2.Effects of riboflavin on TGF-β1and PAI-1 in kidney.DM:diabetic model;RB:DM+ribofavin..n=6.*P <0.05,**P <0.01 vs DM.圖2 核黃素對腎組織TGF-β1和 PAI-1的影響

        6 腎組織形態(tài)學改變

        糖尿病組大鼠腎小球明顯充血水腫,體積增大,腎小管上皮細胞變性壞死脫落,基底膜破壞,部分結構不清。核黃素治療組大鼠腎臟只有較輕微的充血,管腔分開,基底膜完整,結構清晰,腎小球和腎小管結構接近正常,見圖3。

        討 論

        DN是糖尿病中發(fā)病率較高的慢性并發(fā)癥,也是終末期腎衰竭(end stage renal disease,ESRD)及糖尿病病死率增加的重要因素[11]。已成為當前醫(yī)學界重點研究課題。

        研究顯示,DN的發(fā)生、發(fā)展與氧化應激密切相關。近年研究表明持續(xù)的高血糖引起的腎血流動力學改變、糖代謝異常伴蛋白及脂代謝異常是DN病變的基礎,細胞因子被激活是DN病變的直接機制,氧化應激是它們的共同機制[4,12]。我們推測作為抗氧化維生素之一的核黃素對DN可能具有保護作用。本實驗,我們以核黃素喂養(yǎng)糖尿病大鼠對其進行一段時間的治療,檢測大鼠24 h尿蛋白量、腎臟臟器指數(shù)均低于糖尿病大鼠,表明經(jīng)治療后的大鼠腎臟損傷減輕。本實驗研究結果提示核黃素可減輕或延緩DN的發(fā)生發(fā)展,對糖尿病腎臟具有一定的保護作用。

        Figure3.Kidney pathology of rats from NC,DM,RB groups(HE,×400).NC:normal control;DM:diabetic model;RB:DM+riboflavin.圖3 NC、DM、RB組腎組織病理比較

        在本研究,我們對大鼠血清和腎皮質組織中抗氧化酶SOD和CAT活性的檢測發(fā)現(xiàn),經(jīng)核黃素治療,糖尿病大鼠的抗氧化酶SOD和CAT活性有明顯的提高,提示核黃素能夠改善STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟的抗氧化能力,與在腎組織中檢測的過氧化產(chǎn)物丙二醛的含量相一致。表明核黃素可能是通過提高抗氧化、抗炎能力的機制保護糖尿病大鼠腎臟。

        DN在病理上主要表現(xiàn)為腎臟肥大、基底膜增厚及腎小球和腎小管間質細胞外基質(ECM)進行性積聚[13],在這一過程中,TGF - β1、PAI-1 參與并發(fā)揮重要作用。TGF-β1是一種強效的致纖維化因子,是DN發(fā)展過程中的核心因子[8]。糖尿病的重要表現(xiàn)是高血糖,高糖可激活PKC,導致TGF-β1表達升高[8],促使腎臟細胞發(fā)生細胞肥大、增加系膜細胞胞外基質的產(chǎn)生、并通過增加基質降解酶抑制物活性,抑制基質降解酶合成而減少細胞外基質的降解,從而加速DN的發(fā)生發(fā)展,造成腎臟的持續(xù)損害。

        PAI-1主要由血管內皮細胞合成,可抑制纖溶酶原的活化,降低ECM的降解,促進組織ECM的積聚,加速DN的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)高糖、TGF-β1和由糖氧化酶產(chǎn)生的過氧化氫能上調PAI-1 mRNA及蛋白的表達,同時顯著抑制纖維蛋白溶酶活性,抗氧化劑能抑制這種作用[14,15]。PAI-1 的表達與糖尿病患者腎損害(蛋白尿)的程度呈正相關。通過基因轉染技術使PAI-1基因在腎臟中定位表達,結果顯示,隨PAI-1表達水平增加,局部出現(xiàn)ECM過度積聚[11],在腎小球纖維化區(qū)域也可檢測出 PAI-1表達增高。以上表明 PAI-1是引起腎臟損傷的重要物質。另有研究證實,腎臟局部TGF-β1增加時,PAI-1的合成增加,PA的活性降低,基質中PAI-1的沉積增多。用抗TGF-β1的抗體可阻斷PAI-1的增加[15]。因此,一定程度上抑制糖尿病腎臟TGF-β1、PAI-1的表達可以減輕糖尿病腎臟的損傷。

        本研究Western blotting結果顯示,糖尿病大鼠經(jīng)核黃素治療后,腎皮質TGF-β1蛋白及PAI-1蛋白表達明顯降低,提示核黃素可能通過提高機體的抗氧化能力抑制腎組織TGF-β1、PAI-1蛋白表達,減輕糖尿病腎臟損傷。核黃素具有明顯的抗氧化作用[10],本研究也證明核黃素可提高STZ誘導的糖尿病大鼠的抗氧化能力,提示核黃素對DN的保護作用機制可能是通過提高機體的抗氧化性,抑制腎皮質TGF-β1蛋白及PAI-1蛋白表達,使腎小管間質細胞外基質減少,或降解相對增多,從而減輕或延緩DN的發(fā)生發(fā)展。

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