安敏，高福，齊建勛，李鋒，劉杏忠

中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 真菌地衣系統(tǒng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)

靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8的制備和晶體分析

安敏，高福，齊建勛，李鋒，劉杏忠

中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 真菌地衣系統(tǒng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

LZ-8蛋白是從靈芝菌絲中分離到的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，具有多種免疫調(diào)節(jié)功能，然而這一蛋白的作用機(jī)制尚不清楚。通過(guò)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的解析，能夠得到蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，從而闡述蛋白質(zhì)功能的機(jī)制。旨在得到LZ-8蛋白的晶體，并獲得空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。以pET21a為表達(dá)載體，獲得誘導(dǎo)表達(dá)的rLZ-8，通過(guò)親和層析、分子篩凝膠層析和陰離子交換層析純化，蛋白純度在98%以上，采用懸滴氣相擴(kuò)散法得到蛋白晶體，并獲得3.2?數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步對(duì)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白功能和結(jié)構(gòu)的研究奠定了基礎(chǔ)。

LZ-8，真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，晶體衍射

Abstract:LZ-8 protein, isolated from a well known Chinese traditional medicinal fungusGanoderma lucidum, is the first member of fungal immunomodulatory protein, members of which have been isolated from a variety of medicinal and edible mushrooms in the last two decades. The protein plays a multifunctional and important role in modulating immune system. In this report, in order to get LZ-8 protein crystals, the LZ-8 gene was expressed and purified by affinity chromatography, gel filtration chromatography and anion exchange chromatography subsequently. The protein was then crystallized using the hanging-drop vapour-diffusion method. The LZ-8 crystals were obtained and the phase information was calculated by X-ray diffraction. The resolution of LZ-8 crystals is 3.2?. This study will provide an insight into the structure of fungal immunomodulatory proteins.

Keywords:LZ-8, fungal immunomodulatory protein, crystal diffraction

擔(dān)子菌綱多孔菌目靈芝屬的靈芝Ganoderma lucidum是傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中被廣泛應(yīng)用的一種中藥材，在我國(guó)的眾多古典醫(yī)學(xué)資料中都對(duì)它有詳盡的描述。作為一種重要的中藥材，靈芝在抗腫瘤、保肝解毒、治療心血管系統(tǒng)疾病、抗神經(jīng)衰弱作用、抗菌消毒以及抗衰老等多種臨床應(yīng)用方面具有良好的效果[1]。經(jīng)過(guò)研究分析，靈芝中的主要有效化學(xué)成分包括多糖類(lèi)化合物、甾、萜類(lèi)化合物、生物堿、氨基酸和蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)[1]。其中在靈芝中發(fā)現(xiàn)的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8 (LingZhi-8)[2]成為了近幾年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

1989年日本科學(xué)家 Kino首次從靈芝菌絲體中提取到了一個(gè)由111個(gè)氨基酸構(gòu)成的12 kDa大小的小分子蛋白——LZ-8蛋白。之后，科學(xué)家又從藥、食用真菌松杉靈芝G. tsugae[3]、金針菇Flammulina velutipers[4]、草菇Volvariella volvacea[5]、牛樟芝Antrodia camphorata[6]、紫芝G. sinensis[7]等真菌菌絲或子實(shí)體中提取到了性質(zhì)、功能與LZ-8非常相似的蛋白，科學(xué)家將這一類(lèi)蛋白歸為同一個(gè)蛋白家族，命名為真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白 (Fungal immunomodulatory protein，F(xiàn)IP) 家族。以L(fǎng)Z-8為代表的這一蛋白家族具有很多類(lèi)似的免疫調(diào)節(jié)功能。在體外，LZ-8可以刺激DBA/2小鼠[8]、非肥胖性I型糖尿病小鼠脾淋巴細(xì)胞[9]增殖，促進(jìn)單核細(xì)胞起源的樹(shù)突狀細(xì)胞(DC) 的活化和成熟[10]，而且用酵母異源表達(dá)的LZ-8蛋白可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用[11]。這種增殖功能也有類(lèi)似于凝集素的劑量依賴(lài)特點(diǎn)，但不會(huì)因?yàn)槎嗵腔蛘邌翁堑募尤攵艿揭种芠2]。在體內(nèi)，LZ-8蛋白可以防止非肥胖性I型糖尿病小鼠由自身免疫系統(tǒng)缺陷造成的胰腺炎的發(fā)生[9]，同時(shí)也能夠抑制阿爾圖斯 (Arthus) 過(guò)敏反應(yīng)[2]，可能原因是LZ-8蛋白能夠抑制由特殊抗原引起的抗體產(chǎn)生[12]，因此在移植外源胰臟的小鼠體內(nèi)腹腔注射 LZ-8蛋白可以抑制胰臟的排異反應(yīng)，延長(zhǎng)小鼠壽命[13]。此外，LZ-8蛋白可以促進(jìn)黏附分子ICAM-1的表達(dá)[14]，從而促進(jìn)了免疫分子與其他細(xì)胞分子間的相互黏合，以達(dá)到發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的功能。同時(shí)，與LZ-8蛋白氨基酸序列完全相同的松杉靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIP-gts) 可以促進(jìn)人類(lèi)外周血淋巴細(xì)胞分泌白介素2 (IL-2)、白介素 4 (IL-4)、腫瘤壞死因子 α (TNF-α) 和干擾素γ (INF-γ) 等細(xì)胞因子[3]，調(diào)節(jié)人類(lèi)體液免疫。

雖然以 LZ-8蛋白為代表的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白家族的功能已經(jīng)得到了多方面的研究，然而這類(lèi)蛋白的作用機(jī)制仍沒(méi)有得到很好的闡述。由于蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)所具有的功能，因此對(duì)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的研究能夠從本質(zhì)上揭示蛋白的作用機(jī)制。2003年，該家族的第一個(gè)晶體結(jié)構(gòu)——金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白 (FIP-fve) 的晶體結(jié)構(gòu)被解析，對(duì)這個(gè)家族蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有了初步了解，然而并不能完全解釋該蛋白家族功能機(jī)制[15-17]。本研究通過(guò)原核系統(tǒng)大量表達(dá)重組LZ-8蛋白，采用懸滴氣相擴(kuò)散法得到蛋白結(jié)晶，利用 X-光晶體衍射技術(shù)獲得LZ-8蛋白在分辨率為3.2 ?空間結(jié)構(gòu)的信息。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

靈芝G. lucidum菌種444為中國(guó)科學(xué)院微生物研究所文華安教授提供；克隆宿主菌E. coliDH5α，表達(dá)宿主菌E. coliBL21(DE3)，表達(dá)質(zhì)粒 pET21a均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 化學(xué)試劑和材料

蛋白胨、酵母抽提物購(gòu)自O(shè)xoid公司。各種工具酶、混合dNTPs、DNA電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)、pMD18-T simple載體購(gòu)自大連TaKaRa公司。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物技術(shù)公司。DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Promega公司。Ni-NTA Agarose購(gòu)自GE公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher公司。分子篩柱Superdex 75 10/300 GL和陰離子交換柱Resource Q均為Amersham Bioscience公司生產(chǎn)。晶體初篩試劑盒購(gòu)自Hampton Research公司。引物合成和測(cè)序反應(yīng)由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。其他各種化學(xué)試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，Amp終濃度100 μg/mL。PDA綜合培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L；蛋白胨3.0 g/L；KH2PO43.0 g/L；MgSO4·7H2O 1.5 g/L；維生素 B120 mg/L；馬鈴薯浸取液 (去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1.0 L煮沸30 min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1.0 L)；pH 6.0。

1.4 重組質(zhì)粒pET21a-LZ-8的構(gòu)建

將菌種444在PDA綜合培養(yǎng)基培養(yǎng)2周后，收集菌絲球。由于LZ-8基因中不含內(nèi)含子[2]，因此利用酚-氯仿法提取菌種的基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃ 3 min ；95℃30s，55℃30s，72℃45 s，循環(huán) 30次；72 ℃ 10 min 。PCR 引物如下：F：5′-GGAATTCCATATGATGTCCG ACACTGCCTTGAT-3′，R：5′-GGAATTCTTAATGAT GATGATGATGATGAGTTCCACTGGGCG-3′。引物R含有表達(dá)6個(gè)His的序列，F(xiàn)和R分別含有NdeI和EcoRI的限制性酶切位點(diǎn) (下劃線(xiàn)部分為酶切位點(diǎn))，將擴(kuò)增后的目的片段經(jīng)過(guò)酶切、純化連接到表達(dá)載體 pET21a上，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET21a-LZ-8。重組質(zhì)粒通過(guò)酶切鑒定和 DNA測(cè)序來(lái)確保其準(zhǔn)確性。

1.5 rLZ-8蛋白的表達(dá)純化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，在37℃條件下用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h，得到可溶性表達(dá)的目的蛋白。大量搖菌、超聲破碎后，將離心得到的上清與Ni-NTA Agarose結(jié)合2 h。之后用200 mmol/L的咪唑溶液洗脫目的蛋白。濃縮后進(jìn)一步通過(guò)凝膠層析法和陰離子交換層析得到純化的帶有His-tag的rLZ-8蛋白。

1.6 rLZ-8蛋白的晶體生長(zhǎng)

利用結(jié)晶試劑盒，采用懸滴法篩選 rLZ-8蛋白晶體培養(yǎng)條件。通過(guò)初篩條件，改變沉淀劑濃度、鹽濃度、pH值以及蛋白濃度進(jìn)行優(yōu)化。最終在沉淀劑為 0.6 mol/L酒石酸鉀鈉 (Potassium sodium tartrate)，緩沖液0.1 mol/L 1,3-二［三 (羥甲基) 甲氨基］丙烷 (Bis-tris propane)，pH 7.5的條件下獲得可供衍射的晶體，此時(shí)蛋白濃度為5 mg/mL。

1.7 解析結(jié)構(gòu)方法

利用分子置換法解析結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET21a-LZ-8的構(gòu)建和表達(dá)

利用靈芝的基因組 DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到LZ-8基因片段，純化回收后將其連接在pMD18-T simple載體上，經(jīng)菌落PCR和雙酶切鑒定后，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，并利用NdeI和EcoRI進(jìn)行雙酶切?；厥占兓p酶切后獲得的片段，連接到pET21a載體中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，最后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，最終獲得重組質(zhì)粒命名為 pET21a-LZ-8(圖 1)。

圖1 LZ-8基因PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.1 PCR amplification of LZ-8 gene and double enzyme digestion of the recombinant plasmid. (A) PCR amplification of LZ-8 gene. M: DNA marker; 1: PCR product of LZ-8. (B)Double enzyme digestion of the recombinant plasmid. M: DNA marker; 2: double enzyme digestion of pET21a-LZ-8 byNdeI andEcoR I.

2.2 rLZ-8蛋白的表達(dá)純化

將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21(DE3) 中，挑取單克隆后液體培養(yǎng)，在OD500達(dá)到0.4～0.6之間時(shí)加入1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析表明，在接近14 kDa處有一條明顯的目的蛋白帶。超聲裂解細(xì)菌后離心，目的蛋白以可溶性蛋白形式存在，表達(dá)量很高 (圖2)。

圖2 SDS-PAGE分析rLZ-8表達(dá)產(chǎn)物Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression of rLZ-8. M:protein marker; 1?3: rLZ-8 expression after induced by IPTG;4: negative control; 5: the supernatant after sonicating the cells expressing rLZ-8.

將超聲裂解細(xì)菌的產(chǎn)物在4℃下16 000 r/min高速離心10 min，取上清與Ni-NTA Agarose結(jié)合4 h，用50 mmol/L咪唑溶液清洗結(jié)合到層析柱上的雜蛋白直到蛋白檢測(cè)液不再變藍(lán)，之后用200 mmol/L的咪唑溶液將目的蛋白洗脫。濃縮洗脫下來(lái)的目的蛋白至體積約為5 mL，加樣至Superdex 75 10/300 GL進(jìn)行凝膠層析。主峰中的樣品經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證是LZ-8重組蛋白。蛋白出峰位置的分子量約為28 kDa，是蛋白形成二聚體后的分子量大小，即帶有His-tag的rLZ-8蛋白與天然狀態(tài)的 LZ-8蛋白一樣是以二聚體形式存在 (圖3)。將主峰中的蛋白收集，濃縮到5 mL左右，再通過(guò)陰離子交換層析進(jìn)一步純化。通過(guò)SDS-PAGE的驗(yàn)證，陰離子交換層析主峰中的蛋白為目的蛋白 (圖4)。

圖3 rLZ-8蛋白分子篩層析圖Fig.3 Superdex 75 gel filtration profile of the rLZ-8 protein.The main peak is rLZ-8 protein.

圖4 rLZ-8蛋白陰離子交換層析圖Fig.4 Further purification of the rLZ-8 protein by anion exchange. M: protein marker. The main peak is rLZ-8 protein.

2.3 rLZ-8蛋白晶體的生長(zhǎng)

將陰離子交換層析純化后主峰中的蛋白濃縮至 5 mg/mL的濃度，利用懸滴法以及晶體試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行晶體形成條件初篩。在初篩約24 h后，觀(guān)察發(fā)現(xiàn)在Salt以及Crystal試劑盒的22個(gè)條件有晶體長(zhǎng)出，利用 X-ray衍射鑒定是蛋白質(zhì)晶體。初篩時(shí)的蛋白晶體個(gè)體較小，形狀不規(guī)則，很多小晶體混雜生長(zhǎng)在一起，衍射率較低 (圖5A)。之后，對(duì)初篩時(shí)晶體生長(zhǎng)較大、較結(jié)實(shí)的條件進(jìn)行鹽離子濃度和pH值的梯度優(yōu)化，在0.6 mol/L酒石酸鉀鈉沉淀劑、0.1 mol/L Bis-tris propane緩沖液 (pH 7.5)的條件下得到了分辨率為3.2 ?的晶體。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的晶體個(gè)體較大，形狀為較規(guī)則的六邊形，晶體為單個(gè)晶體，而且比較厚實(shí)，分辨率較高 (圖5B)。

圖5 初篩 (A) 及優(yōu)化 (B) 條件的rLZ-8晶體形態(tài)Fig.5 Initial (A) and optimized (B) crystals of the rLZ-8 protein.

2.4 rLZ-8晶體衍射數(shù)據(jù)的收集

利用 X-ray衍射設(shè)備收集優(yōu)化后的蛋白質(zhì)晶體中各原子的衍射數(shù)據(jù) (圖6)。優(yōu)化數(shù)據(jù)至3.2 ?。晶體屬于P6422空間群，晶胞參數(shù)分別為：a=b=76.473 ?，c=177.476 ?，α=β=90°，γ=120°。通過(guò)進(jìn)一步的晶體優(yōu)化可以解析蛋白結(jié)構(gòu) (表 1)。目前正在應(yīng)用分子置換的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

表1 rLZ-8蛋白晶體的衍射數(shù)據(jù)Table 1 X-ray diffraction data of the rLZ-8 protein

圖6 rLZ-8蛋白晶體X射線(xiàn)衍射圖Fig.6 Typical diffraction pattern of the rLZ-8 protein.

3 討論

本文通過(guò)原核表達(dá)，獲得帶有His-tag的靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8，通過(guò)分子篩層析顯示為二聚體蛋白，與天然LZ-8蛋白相同，均為二聚體蛋白。天然的 LZ-8蛋白不含有 Met、Cys、His[2,17]，所以它們是由非共價(jià)鍵作用形成二聚體的。由于重組表達(dá)的LZ-8蛋白中也不含Cys、Met，因此重組蛋白也是由非共價(jià)鍵作用而生成的二聚體蛋白。這一結(jié)構(gòu)與已經(jīng)解析結(jié)構(gòu)的FIP-fve一致。LZ-8與FIP-fve在氨基酸序列上相似性很高，推測(cè)LZ-8與FIP-fve應(yīng)該有很相似的晶體結(jié)構(gòu)。通過(guò)這一結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步解析，可以解釋真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白所具有的免疫調(diào)節(jié)功能的本質(zhì)原因。

本研究成功獲得了LZ-8的蛋白晶體，并且獲得了3.2 ?的數(shù)據(jù)，通過(guò)進(jìn)一步蛋白晶體優(yōu)化，提高晶體各原子相位分辨率，將對(duì)晶體結(jié)構(gòu)的解析提供良好的數(shù)據(jù)，為解釋以L(fǎng)Z-8蛋白為代表的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的功能以及對(duì)該家族蛋白的應(yīng)用提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

本研究雖然對(duì)LZ-8的晶體進(jìn)行過(guò)多次優(yōu)化，但是都沒(méi)有提高分辨率?？赡茉蚴荓Z-8晶體生長(zhǎng)速度太快，使原子沒(méi)有時(shí)間形成有序排列，從而造成分辨率不高。進(jìn)一步晶體優(yōu)化過(guò)程中，如果能夠減慢晶體的生長(zhǎng)速度，將有助于原子形成有序排列，從而使分辨率提高。

對(duì)重組LZ-8結(jié)構(gòu)的解析確定，將有利于對(duì)LZ-8蛋白開(kāi)展功能機(jī)制的進(jìn)一步研究。同時(shí)，這種結(jié)構(gòu)研究方法可以應(yīng)用于中草藥的其他蛋白的結(jié)構(gòu)及功能研究，為我國(guó)的中醫(yī)研究應(yīng)用提供更多支持。

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Expression and crystallographic studies of a fungal immunomodulatory protein LZ-8 from a medicinal fungusGanoderma lucidum

Min An, George Fu Gao, Jianxun Qi, Feng Li, and Xingzhong Liu

Key Laboratory of Systematic Mycology and Lichenology,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China

Received:April 21, 2010;Accepted:May 10, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA021506).

Corresponding author:Xingzhong Liu. Tel: +86-10-64807505; E-mail: liuxz@im.ac.cn

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2007AA021506) 資助。