楊卓娜，姜岷，李建，方曉江，葉貴子，白雪飛，鄭曉宇，韋萍

南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009

工業(yè)生物技術(shù)

不同pH調(diào)節(jié)劑對(duì)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌NJ113發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響

楊卓娜，姜岷，李建，方曉江，葉貴子，白雪飛，鄭曉宇，韋萍

南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009

在 3 L發(fā)酵罐中分別采用不同的堿性物質(zhì)作為 pH調(diào)節(jié)劑，考察其對(duì)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenesNJ113厭氧發(fā)酵制備丁二酸的影響。結(jié)果表明：Ca2+、NH4+調(diào)節(jié)劑對(duì)菌體生長(zhǎng)代謝有較大阻礙作用，丁二酸產(chǎn)量較低；采用含 Na+調(diào)節(jié)劑，在發(fā)酵中后期菌體出現(xiàn)絮凝現(xiàn)象嚴(yán)重，且產(chǎn)丁二酸能力驟降；采用含 Mg2+調(diào)節(jié)劑，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程菌體代謝旺盛，發(fā)酵效果較佳。根據(jù)各堿性物質(zhì)的調(diào)節(jié)能力以及對(duì)菌體生長(zhǎng)代謝的影響，選擇 NaOH、Mg(OH)2和Na2CO3、Mg(OH)2分別作為混合堿組分調(diào)節(jié)pH，并對(duì)兩組混合堿中各物質(zhì)的質(zhì)量比例進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，以NaOH、Mg(OH)2混合，兩者質(zhì)量比為1∶1時(shí)，發(fā)酵效果最好，丁二酸質(zhì)量濃度高達(dá)到69.8 g/L，質(zhì)量收率74.5%。該種混合堿配比可有效替代堿式MgCO3調(diào)節(jié)pH，既達(dá)到高產(chǎn)丁二酸的目的，又可降低生物制備丁二酸的成本。

pH調(diào)控，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌NJ113，丁二酸，發(fā)酵，混合堿

Abstract:Different neutralizing agents were used as pH controller to investigate their effects on the growth and succinic acid production ofActinobacillus succinogenesNJ113. The fermentation results showed that Ca(OH)2, CaCO3and NH4OH were not suitable for succinic acid production byA. succinogenesNJ113 because of their negative effects on cell growth. When Na-base was used, cells would flocculate and lump, and due to the sodium ion concentration reaching to a high level,OD660dropped sharply after 12 h of fermentation. Mg-base was better because there was no significant inhibition by magnesium ion. Two combined neutralizing agents were used to maintain pH level, one with NaOH and Mg(OH)2while the other with Na2CO3and Mg(OH)2. The optimum ratios of the combined neutralizing agents were both 1:1(g:g) when using 100 g/L glucose. When NaOH and Mg(OH)2were chosen with the ratio of 1:1(g:g), 69.8 g/L of the succinic acid and 74.5% of the yield was obtained.

Keywords: pH control,Actinobacillus succinogenesNJ113, succinic acid, fermentation, mixed neutralizing agents

丁二酸，又名琥珀酸，是一種二元羧酸，作為重要的C4平臺(tái)化合物，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、香料、洗滌劑、精細(xì)化工產(chǎn)品、表面活性劑生物可降解材料等方面。丁二酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是以石油為原料用化學(xué)法進(jìn)行煉制合成。而隨著石油資源日益枯竭，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸以其環(huán)境友好性、可利用廢棄的生物質(zhì)資源、能夠固定溫室氣體 CO2等優(yōu)點(diǎn)，成為研究的熱門(mén)課題，為已存在的丁二酸化學(xué)制品市場(chǎng)提供一種新型的環(huán)保產(chǎn)品來(lái)源[1]。

以生物法制備丁二酸，CO2、pH是影響菌體生長(zhǎng)和丁二酸產(chǎn)量的關(guān)鍵因素[2-3]。CO2在菌體的生長(zhǎng)代謝過(guò)程中作為碳源被菌體利用，合成目的產(chǎn)物丁二酸。環(huán)境pH的改變不僅會(huì)引起菌體內(nèi)外部化學(xué)環(huán)境和酶活力的變化，對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)生影響，而且還可以影響CO2的溶解水平，以及HCO3?、CO32?的解離平衡，進(jìn)而影響丁二酸的合成。所以在發(fā)酵過(guò)程中維持pH在適宜水平，對(duì)提高菌體的代謝活性和產(chǎn)酸能力具有重要作用。

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵最佳pH為7.0[4]。在發(fā)酵過(guò)程中，有機(jī)酸的積累會(huì)導(dǎo)致pH下降，需要添加pH調(diào)節(jié)劑來(lái)維持環(huán)境的中性水平。MgCO3是較好的中和劑[3]，具有較好的調(diào)節(jié)能力。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加MgCO3固體，能夠?qū)H維持在適宜的水平，菌體在發(fā)酵過(guò)程中表現(xiàn)出較高的代謝活性。但是MgCO3成本較高，消耗量較大，且增加了下游產(chǎn)品分離提取的難度，不利于生物法制備丁二酸的工業(yè)化。因此，需要選擇合適的pH調(diào)節(jié)劑并制定合理的調(diào)節(jié)策略來(lái)優(yōu)化生產(chǎn)工藝，降低生物制備丁二酸的生產(chǎn)成本。

初糖濃度對(duì)菌體發(fā)酵產(chǎn)酸有重要影響。較高的初糖濃度會(huì)延長(zhǎng)菌體的延滯期，降低最大菌體量，但是能夠提高丁二酸的絕對(duì)產(chǎn)量[2]。本文采用Ca(OH)2、CaCO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、Mg(OH)2、堿式 MgCO3作為 pH調(diào)節(jié)劑，考察不同pH調(diào)節(jié)方式對(duì)A. succinogenesNJ113厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響。根據(jù)以上各堿性物質(zhì)的調(diào)節(jié)能力和特性制定了采用混合堿調(diào)控pH的策略，并確定混合成分及其最佳配比，為優(yōu)化丁二酸發(fā)酵工藝提供有價(jià)值的技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenesNJ113，保存號(hào)CGMCC 1716，本實(shí)驗(yàn)室篩選并保存。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖10 (分消)，酵母膏5，NaHCO310，NaH2PO4·2H2O 9.6，K2HPO4·3H2O 15.5；pH 6.8，121℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖80～100，酵母膏10，KH2PO43，MgCl2·6H2O 0.3，CaCl20.3，NaCl 1，Na2HPO40.31，NaH2PO41.6，121℃滅菌 15 min。葡萄糖 121℃分消 15 min 后單獨(dú)加入。固體CaCO3、堿式MgCO3在滅菌前加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他堿液以流加形式加入，控制pH在7.0。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，取平均值。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1種子培養(yǎng)

凍存于?70℃冰箱的菌種，接到種子培養(yǎng)基中，120 r/min，37℃活化10 h后作為種子液。

1.3.2分批發(fā)酵培養(yǎng)

在3 L發(fā)酵罐 (BioFlo 110 fermenter；NBS) 進(jìn)行分批發(fā)酵培養(yǎng)，裝液量為1.5 L，接種量5%。攪拌轉(zhuǎn)速 200 r/min，溫度37℃，CO2通氣量0.25 L/min。

1.4 分析方法

1.4.1葡萄糖含量的測(cè)定

生物傳感分析儀 (SBA240C，山東省科學(xué)院生物研究所)。

1.4.2有機(jī)酸含量測(cè)定

采用高效液相方法 (HPLC) 測(cè)得有機(jī)酸[5](戴安 Ultimate3000系列)。色譜柱：Alltech Prevail Organic Acid (250 mm×φ4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：25 mmol/L KH2PO4；pH 2.5；流動(dòng)相流速：1 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm；進(jìn)樣量20 μL；柱溫為室溫。采用Ca2+調(diào)節(jié)時(shí)，用HCl調(diào)節(jié)離心后沉淀的pH至2.5，使少量沉淀丁二酸鈣溶解，經(jīng)離心后采用高效液相方法測(cè)得上清液中丁二酸含量。

1.4.3菌體濃度的測(cè)定

取1 mL菌液，稀釋若干倍，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (Spectrumlab 752S) 于660 nm (OD660) 處測(cè)定吸光值。若發(fā)酵液中含有Mg(OH)2或MgCO3，稀釋前在待測(cè)樣中加入適量2 mol/L HCl，再進(jìn)行吸光值測(cè)定。

1.4.4菌體干重的測(cè)定

將干燥10 mL離心管稱(chēng)重 (G1)，取5 mL發(fā)酵液于離心管中，10 000 r/min離心10 min，倒出上清液，5 mL 0.9%的生理鹽水洗滌2次，將沉淀物連同離心管置于60℃烘箱中烘干至恒重，取出稱(chēng)重 (G2)：

細(xì)胞干重W (g/mL) = (G2?G1)/5。

2 結(jié)果

2.1 不同 pH 調(diào)節(jié)劑對(duì)菌體生長(zhǎng)和丁二酸產(chǎn)量的影響

2.1.1Ca2+調(diào)節(jié)劑 (Ca(OH)2、CaCO3)

在3 L發(fā)酵罐中分別采用Ca(OH)2、CaCO3調(diào)節(jié)pH進(jìn)行發(fā)酵，初始葡萄糖80 g/L，結(jié)果見(jiàn)圖1。采用 Ca(OH)2調(diào)節(jié)，菌體幾乎不生長(zhǎng)，丁二酸質(zhì)量濃度小于5 g/L (圖1A)。采用事先添加CaCO3調(diào)節(jié)pH發(fā)酵，菌體生長(zhǎng)比 Ca(OH)2調(diào)節(jié)發(fā)酵時(shí)稍好，但仍受到明顯抑制。CaCO3的溶解能力差，不能將pH維持在適合菌體生長(zhǎng)的水平，發(fā)酵過(guò)程中 pH不斷降低，至發(fā)酵結(jié)束，pH降至5.6 (圖1B)，丁二酸產(chǎn)量?jī)H為17.5 g/L。

圖1 采用2.5 mol/L Ca(OH)2(A) 和40 g/L CaCO3(B) 調(diào)節(jié)pH的發(fā)酵過(guò)程圖Fig.1 Time courses of the succinic acid fermentation using 2.5 mol/L Ca(OH)2(A) and 40 g/L CaCO3(B) to buffer pH.

已有研究表明，Ca2+對(duì)丁二酸生產(chǎn)菌Mannheimia succiniciproducens具有毒害作用[6]。Ca2+可以改變細(xì)胞膜正常的流動(dòng)性和通透性[7]，致使菌體不能進(jìn)行正常的胞內(nèi)外物質(zhì)能量傳遞，從而無(wú)法生長(zhǎng)代謝。

2.1.2Na+調(diào)節(jié)劑 (NaOH、Na2CO3、NaHCO3)

在 3 L發(fā)酵罐中分別采用 NaOH、Na2CO3、NaHCO3調(diào)節(jié) pH，發(fā)酵過(guò)程見(jiàn)圖 2。發(fā)酵前期，菌體生長(zhǎng)旺盛，大量合成產(chǎn)物丁二酸，至中后期菌體OD660均呈明顯下降趨勢(shì)，菌體絮凝現(xiàn)象嚴(yán)重，丁二酸的生產(chǎn)能力也逐漸下降。對(duì)比發(fā)酵結(jié)果 (表1) 可知，采用NaOH調(diào)節(jié)，丁二酸產(chǎn)量最高，為41.94 g/L，但是糖利用率較僅有66.67%，有較多葡萄糖殘留，發(fā)酵液中積累的 Na+達(dá)到 2.1 mol/L。Na2CO3、NaHCO3能夠提供額外的 CO32?、HCO3?，有利于菌體合成丁二酸，但是兩者溶解性和堿性均較低，流加過(guò)程對(duì)發(fā)酵液的稀釋作用顯著，以 NaHCO3尤為嚴(yán)重，雖然糖利用率較高 (98.7%)，但是丁二酸質(zhì)量濃度僅為37.77 g/L。

表1 采用不同含Na+調(diào)節(jié)劑發(fā)酵結(jié)果的對(duì)比aTable 1 Results of succinic acid production using different Na-base for pH control

圖2 采用 10 mol/L NaOH (A)、2.5 mol/L Na2CO3(B)和2.4 mol/L NaHCO3(C) 調(diào)節(jié)pH的發(fā)酵過(guò)程圖Fig.2 Time courses of the succinic acid fermentation using 10 mol/L NaOH (A), 2.5 mol/L Na2CO3(B) and 2.4 mol/L NaHCO3(C) to buffer pH at 7.0.

在細(xì)胞的代謝過(guò)程中，Na+有十分重要的作用，它能夠影響跨膜pH梯度、細(xì)胞滲透壓以及胞內(nèi)pH調(diào)控水平[8]。Pyung等報(bào)道，當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl質(zhì)量濃度高于4 g/L時(shí)，Anaerobiospirillum succinicproducens最高OD660值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，丁二酸的產(chǎn)量也隨之下降[9]。在發(fā)酵過(guò)程中采用含Na+調(diào)節(jié)劑，則Na+不斷積累。至發(fā)酵中后期，發(fā)酵液中 Na+濃度均處于較高水平，造成高滲環(huán)境。這對(duì)菌體有較大的負(fù)面作用，使細(xì)胞不能正常代謝，最終導(dǎo)致衰亡。

2.1.3Mg2+調(diào)節(jié)劑 (Mg(OH)2、堿式MgCO3)

Mg2+是許多酶的激活劑，在丁二酸合成途徑中的關(guān)鍵酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶需要Mg2+作為輔助因子[10]。圖3是分別采用Mg(OH)2、MgCO3調(diào)節(jié)pH的發(fā)酵過(guò)程，初始葡萄糖濃度80 g/L。Mg2+在發(fā)酵液中的積累對(duì)菌體生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的抑制作用，發(fā)酵中后期，OD660緩慢下降，菌體仍有較高的代謝活性。采用Mg(OH)2調(diào)節(jié)，由于堿液流加的稀釋作用，丁二酸質(zhì)量濃度僅為42.92 g/L (圖3A)。以堿式MgCO3調(diào)節(jié)pH，發(fā)酵效果最佳，至發(fā)酵結(jié)束，丁二酸質(zhì)量濃度達(dá) 57.36 g/L (圖 3B)，質(zhì)量收率為71.86%。

圖3 采用 (A) 15% Mg(OH)2和 (B) 70 g/L堿式MgCO3調(diào)節(jié)pH的發(fā)酵過(guò)程圖Fig.3 Time courses of the succinic acid fermentation using 2.6 mol/L Mg(OH)2(A) and 70 g/L MgCO3(B) to buffer pH at 7.0.

2.1.4NH4+調(diào)節(jié)劑 (氨水)

氨水調(diào)節(jié)pH的發(fā)酵過(guò)程如圖4所示。發(fā)酵液中NH4+對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用較為強(qiáng)烈，菌體對(duì)糖的利用能力較低，導(dǎo)致大量的葡萄糖殘留。至發(fā)酵結(jié)束，丁二酸質(zhì)量濃度僅為23.5 g/L。

細(xì)胞膜對(duì)NH4+有較高的通透性[11]，NH4+的滲入會(huì)造成胞內(nèi)pH水平發(fā)生變化，細(xì)胞需要更多的能量將 NH4+泵出，可見(jiàn)，環(huán)境中較高 NH4+濃度會(huì)降低細(xì)胞對(duì)能量的利用效率。當(dāng)能量供給不足時(shí)，受胞內(nèi)NH4+的影響，胞內(nèi)的pH發(fā)生變化，影響細(xì)胞無(wú)法正常的生長(zhǎng)代謝，最終導(dǎo)致死亡[11-13]。

圖4 采用14 mol/L氨水調(diào)節(jié)pH的發(fā)酵過(guò)程圖Fig.4 Time course of the succinic acid fermentation using 14 mol/L NH4OH to buffer pH at 7.0.

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，采用含Ca2+、NH4+調(diào)節(jié)劑，菌體生長(zhǎng)受到較強(qiáng)的抑制作用，產(chǎn)酸能力較低，所以這兩類(lèi)調(diào)節(jié)劑不適用于A. succinogenesNJ113產(chǎn)丁二酸的pH控制；采用含Na+調(diào)節(jié)劑，在發(fā)酵中后期菌體絮凝現(xiàn)象嚴(yán)重，耗糖速率、產(chǎn)丁二酸酸能力迅速下降；Mg2+調(diào)節(jié)劑對(duì)菌體的生長(zhǎng)和代謝沒(méi)有明顯的抑制作用，菌體在發(fā)酵過(guò)程中保持較高的活力。綜合各類(lèi)調(diào)節(jié)劑對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用 NaOH、Mg(OH)2和 Na2CO3、Mg(OH)2兩種混合堿分別調(diào)節(jié)pH，以彌補(bǔ)單堿調(diào)節(jié)的不足。

2.2 混合堿調(diào)節(jié) pH 對(duì)菌體生長(zhǎng)以及丁二酸產(chǎn)量的影響

2.2.1NaOH和Mg(OH)2不同的混合比例調(diào)節(jié)pH對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

用NaOH和Mg(OH)2混合溶液作為pH調(diào)節(jié)劑，初始葡萄糖100 g/L，在3 L發(fā)酵罐中考察調(diào)控效果?？刂苹旌蠅A中OH?濃度為6 mol/L (按1 mol Mg(OH)2提供 2 mol OH?計(jì))，NaOH 和 Mg(OH)2質(zhì)量比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，結(jié)果見(jiàn)圖 5。

從圖5中可看出，隨著混合堿液中NaOH添加比例降低，葡萄糖的殘留量逐漸減少。當(dāng)NaOH和Mg(OH)2的質(zhì)量比為1∶1時(shí)，無(wú)葡萄糖剩余，丁二酸的質(zhì)量濃度最高可達(dá)69.8 g/L，發(fā)酵液中Na+濃度為0.86 mol/L，與采用NaHCO3調(diào)節(jié)的Na+濃度相比，降低了42.6%。繼續(xù)減少混合堿中NaOH的添加比例，菌體仍然能夠?qū)⑵咸烟侨亢耐?，但是混合堿的稀釋作用逐漸顯著，丁二酸質(zhì)量濃度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖5 不同比例的NaOH和Mg(OH)2混合調(diào)節(jié)pH對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.5 Comparison of different ratio of NaOH and Mg(OH)2on production of succinic acid in batch fermentation.

2.2.2Na2CO3和Mg(OH)2不同的混合比例調(diào)節(jié)pH對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

采用 Na2CO3和 Mg(OH)2以不同比例混合(3∶1、2∶1、1∶1∶2、1∶3) 調(diào)節(jié) pH，控制混合堿中 OH?濃度為 6 mol/L (按 1 mol Na2CO3提供2 mol OH?計(jì))，初始葡萄糖100 g/L。發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖6。隨著Mg(OH)2添加量的不斷增加，葡萄糖剩余量逐漸減少，丁二酸質(zhì)量濃度逐漸增大。當(dāng) Na2CO3和Mg(OH)2質(zhì)量比達(dá)到1∶1時(shí)，葡萄糖無(wú)剩余，丁二酸質(zhì)量濃度最高，為55.4 g/L，發(fā)酵液中Na+濃度0.95 mol/L，比采用NaHCO3調(diào)節(jié)的Na+濃度降低了36.7%。繼續(xù)增加混合堿中 Mg(OH)2添加量，葡萄糖仍然能夠消耗完全，但是丁二酸的濃度有所下降。

圖6 不同比例的Na2CO3和Mg(OH)2混合調(diào)節(jié)pH對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.6 Comparison of different ratio of Na2CO3and Mg(OH)2on production of succinic acid in batch fermentation.

含 Na+調(diào)節(jié)劑與含 Mg2+調(diào)節(jié)劑混合至適當(dāng)比例，既緩解了 Na+的過(guò)量積累，提高菌體對(duì)糖的利用率，又降低了Mg(OH)2對(duì)發(fā)酵液的稀釋程度。與Na2CO3和Mg(OH)2混合調(diào)節(jié)pH發(fā)酵的最佳結(jié)果相比，采用NaOH和Mg(OH)2以1∶1混合調(diào)節(jié)pH發(fā)酵的效果更好。

表 2的對(duì)比結(jié)果可知，以 NaOH和 Mg(OH)21∶1混合調(diào)節(jié)pH，在高糖濃度下進(jìn)行丁二酸發(fā)酵，菌體能夠有效利用碳源進(jìn)行產(chǎn)物合成，丁二酸的產(chǎn)量以及收率與堿式MgCO3發(fā)酵結(jié)果相近。同時(shí)，采用混合堿發(fā)酵，能夠有效降低丁二酸的生產(chǎn)成本，具有工業(yè)應(yīng)用的潛質(zhì)。

表2 混合堿與堿式MgCO3調(diào)節(jié)pH發(fā)酵結(jié)果對(duì)比Table 2 Results of succinic acid production using mixed neutralizing agents and MgCO3for pH control respectively

3 討論

不同的堿性物質(zhì)對(duì)A. succinogenesNJ113厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸表現(xiàn)出不同的調(diào)節(jié)能力。采用含Ca2+、NH4+調(diào)節(jié)劑進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，菌體生長(zhǎng)受阻，對(duì)糖的利用能力較低，產(chǎn)物丁二酸的合成量較少。采用含Na+調(diào)節(jié)劑，發(fā)酵中后期 Na+造成的高滲環(huán)境對(duì)菌體有毒害作用，菌體代謝能力驟降，糖利用率較低。而含Mg2+調(diào)節(jié)劑對(duì)菌體的生長(zhǎng)與代謝沒(méi)有明顯的阻礙作用，細(xì)胞能夠保持較高的代謝活性。

根據(jù)上述結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用混合堿調(diào)節(jié)策略，即以 NaOH、Mg(OH)2和 Na2CO3、Mg(OH)2混合分別控制 pH，以改善在高糖濃度下菌體對(duì)糖利用率低、丁二酸合成量少等問(wèn)題。采用NaOH、Mg(OH)2質(zhì)量比 1∶1混合調(diào)節(jié) pH，發(fā)酵效果最佳，丁二酸質(zhì)量濃度最高，可達(dá)69.8 g/L，質(zhì)量收率達(dá)到74.5%。以該種混合堿配比調(diào)節(jié)pH發(fā)酵效果較好，可能是由于在該種混合配比下，Mg2+能夠及時(shí)有效地與丁二酸根形成絡(luò)合結(jié)構(gòu)[14]，且Mg2+的供給速率與丁二酸的生產(chǎn)速率達(dá)到一定的平衡，在保證pH維持在適宜水平的前提下，降低產(chǎn)物對(duì)菌體活性的抑制作用。Sergio等報(bào)道在添加Mg2+能夠提高PEP羧化激酶的活性[15]。PEP羧化激酶是合成產(chǎn)物丁二酸的關(guān)鍵酶，PEP羧化激酶活力的提高，能夠促進(jìn) PEP轉(zhuǎn)化為OAA，進(jìn)一步合成目標(biāo)產(chǎn)物丁二酸。同時(shí)，Mg2+也能夠提高胞內(nèi)高能化合物的儲(chǔ)備，為胞內(nèi)代謝以及胞內(nèi)外的物質(zhì)運(yùn)輸提供更多能量支持[16]。在混合堿中，Na+濃度得到有效控制，削弱了Na+對(duì)環(huán)境的高滲作用，有利于菌體的正常代謝。因此，采用混合堿的pH調(diào)節(jié)策略，能夠充分彌補(bǔ)單堿調(diào)節(jié)的不足，改善在高糖濃度下菌體對(duì)糖利用率低、丁二酸合成量少等問(wèn)題，達(dá)到高產(chǎn)丁二酸的目的；同時(shí)，與堿式碳酸鎂的發(fā)酵效果相近，可有效降低生物制備丁二酸的成本，為優(yōu)化生物制備丁二酸的生產(chǎn)工藝奠定良好的基礎(chǔ)。

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Effects of different neutralizing agents on succinate production byActinobacillus succinogenesNJ113

Zhuona Yang, Min Jiang, Jian Li, Xiaojiang Fang, Guizi Ye, Xuefei Bai, Xiaoyu Zheng,and Ping Wei

State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing210009,China

Received:January 29, 2010;Accepted:May 14, 2010

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2009CB724701), National Natural Science Foundation of China (No.20606017), State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, “Qinglan Project” of Jiangsu Province, “The Six Talent Summit” of Jiangsu Province (No. 06-A-047).

Corresponding author:Min Jiang. Tel: +86-25-83172078; Fax: +86-25-83172075; E-mail: jiangmin@njut.edu.cn

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2009CB724701)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 20606017)，材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金，江蘇省“青藍(lán)工程”，江蘇省“六大人才高峰”(No. 06-A-047) 資助。