馮紅波 張軍輝

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是耳鼻咽喉科的常見(jiàn)惡性腫瘤。本實(shí)驗(yàn)初步觀察槲皮素對(duì)人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞增殖及腫瘤相關(guān)基因COX-2、p65和Survivin表達(dá)的影響，為槲皮素在鼻咽癌臨床應(yīng)用及其作用機(jī)制的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑 人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物有限公司，常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)液中(青霉素和鏈霉素濃度為100u/ml)，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。RPMI 1640購(gòu)自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。小牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO。噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和Trizol等試劑購(gòu)自Sigma公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和dNTP mixture購(gòu)自TAKARA(大連寶生物有限公司)。Taq DNA聚合酶購(gòu)自Promega公司。DNA Marker購(gòu)自天根生化科技有限公司。槲皮素購(gòu)自美國(guó)sigma公司，溶于DMSO-20℃避光分裝保存?zhèn)溆?，使用時(shí)應(yīng)用RPMI 1640完全培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度。

1.2 方法

1.2.1 增殖抑制實(shí)驗(yàn) 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2Z細(xì)胞消化收集后計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度，按100μl/孔(含7500個(gè)細(xì)胞)接種于96孔板，過(guò)夜貼壁后加入含有槲皮素終濃度為12.5、25、50、100 μmol/L 的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)5個(gè)復(fù)孔的陰性對(duì)照和空白對(duì)照孔，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h 檢測(cè)。終止培養(yǎng)前 4 h 每孔加入5 mg/m l MTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)至待測(cè)時(shí)間后小心吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加入DMSO 150μl后震蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上以570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值(A值)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率計(jì)算方式:細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組A值-給藥組A值)/對(duì)照組A值×100%。同樣實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 RT-PCR的操作

1.2.3.1 RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 50μmol/L槲皮素分別作用0、24、48、72 h后采用常規(guī) Trizol抽提法提取的總 RNA，RNA電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)28S和18S條帶清晰、銳利、明亮，并經(jīng)紫外分光光度儀進(jìn)行分析A260/A280比值在1.8～2.0之間;取適量RNA做逆轉(zhuǎn)錄模板置入Ep管中逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA，過(guò)程按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，簡(jiǎn)述如下:首先加入olig(dt)1μl，70℃ 5min，取出置入冰盒中降溫，離心3 ～5 s;再依次加入5 ×buffer 4 μl，RNase inhibitor 1 μl，dNTPmixture(10 mM each)2 μl，37℃ 5 min，離心 3 ～5 s;最后加入 M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，42℃ 60 min，70℃ 10 min，結(jié)束反應(yīng);取出置入冰盒中降溫，離心3～5 s。逆轉(zhuǎn)錄成功合成的cDNA直接檢測(cè)或放入-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 PCR擴(kuò)增 PCR引物在線合成并經(jīng)過(guò)特異性檢測(cè)后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，反應(yīng)體系為25μl，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 Sec，退火30 Sec，72℃延伸60 Sec，重復(fù)28個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)完成后取5μl產(chǎn)物與適量上樣緩沖液混合后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并經(jīng)成像儀掃描成像。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SAS6.12和SPSS軟件進(jìn)行，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，MTT結(jié)果做兩因素方差分析，其余多樣本均數(shù)比較做單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)CNE-2Z細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示槲皮素對(duì)CNE-2Z細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性，不同濃度組間、不同時(shí)間組間生長(zhǎng)抑制率均有顯著性差異(P＜0.01)(圖1)。

圖1 槲皮素抑制CNE-2Z細(xì)胞生長(zhǎng)的時(shí)效和量效關(guān)系

2.2 槲皮素對(duì) CNE-2Z細(xì)胞COX-2、p65和Survivin mRNA表達(dá)的影響 槲皮素能明顯的抑制CNE-2Z細(xì)胞COX-2、p65和Survivin mRNA的表達(dá)。50μmol/L槲皮素作用CNE-2Z細(xì)胞后0 h(對(duì)照組)、24、48、72 h可見(jiàn) COX-2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量呈時(shí)間依賴性下調(diào)，不同時(shí)間組間存在顯著性差異(P＜0.01)。50μmol/L槲皮素作用CNE-2Z細(xì)胞后0 h(對(duì)照組)、24、48、72 h可見(jiàn)p65 mRNA的相對(duì)表達(dá)量呈時(shí)間依賴性下調(diào)，不同時(shí)間組間存在顯著性差異(P＜0.01)。50μmol/L槲皮素作用CNE-2Z細(xì)胞后0 h(對(duì)照組)、24、48、72 h可見(jiàn)SurvivinmRNA的相對(duì)表達(dá)量呈時(shí)間依賴性下調(diào)，不同時(shí)間組間存在顯著性差異(P＜0.01)。(表1)。

表1 槲皮素對(duì)CNE-2Z細(xì)胞COX-2、p65和Survivin mRNA表達(dá)的影響(x±s)

3 討論

鼻咽癌是嚴(yán)重影響我國(guó)人民群眾身體健康的惡性腫瘤之一［1］。目前治療鼻咽癌的主要手段為放射治療，但是效果不盡人意。槲皮素是一種天然類黃酮化合物，近年來(lái)對(duì)槲皮素在抗腫瘤方面的作用日益受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)低劑量的槲皮素就能夠顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，其機(jī)制包括抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥等方面［2，3］。本實(shí)驗(yàn)就用槲皮素作用于 CNE-2Z細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素呈時(shí)間和劑量依賴性的抑制CNE-2Z細(xì)胞的增殖，與其他腫瘤細(xì)胞系的報(bào)道相似。

環(huán)氧合酶(COX)有COX-1和COX-2兩種亞型，它是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素(prostaglandin，PGs)的限速酶。細(xì)胞核因子(Nuclear factor kappa B，NF-κB)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，具有多種調(diào)節(jié)作用，它的異常激活或抑制與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，與機(jī)體的免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞周期和凋亡及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。近年來(lái)的研究表明Survivin高表達(dá)與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、放化療敏感性密切相關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)初步探討了槲皮素對(duì)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制，為鼻咽癌的化療藥物治療及槲皮素在鼻咽癌臨床應(yīng)用打下了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］Yu M C，Yuan JM.Epidemiology of nasopharyngeal carcinoma.Semin Cancer Biol，2002，12(6):421-9.

［2］Murakami A，Ashida H，Terao J.Multitargeted cancer prevention by quercetin.Cancer Lett，2008，269(2):315-25.

［3］Demiroglu-Zergeroglu A，Basara-Cigerim B，Kilic E，et al.The investigation of effectsof quercetin and its combination with Cisplatin onmalignantmesothelioma cells in vitro.JBiomed Biotechnol，2010:85-89.