馮向輝,王建永,包永占,趙月蘭,左玉柱,秦建華*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,河北保定 071001;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)院,河北定州 073000)

牛結(jié)核病是由分支桿菌引起的人獸共患的慢性消耗性傳染病。該病的流行與傳播不僅阻礙著畜牧業(yè)的發(fā)展,而且嚴(yán)重的威脅到食品安全和公共衛(wèi)生[1]。消滅牛結(jié)核的惟一方法是通過“檢疫—撲殺”措施淘汰陽性牛,因此,準(zhǔn)確而及時(shí)的診斷方法對該病的控制尤為重要。結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)(tubercu lin skin test,TST)是世界動物衛(wèi)生組織推薦的牛結(jié)核病的診斷方法,但該方法存在明顯的不足之處,即檢測時(shí)易受其他非致病性的分支桿菌的干擾而出現(xiàn)假陽性;感染后期的病牛不敏感;易受人為操作因素影響;對受試牛刺激大等[2-4]。此外,牛結(jié)核病的診斷還有細(xì)菌培養(yǎng)法、γ-干擾素診斷法和分子生物學(xué)檢測[5]等方法,但細(xì)菌培養(yǎng)法耗時(shí)長,檢出率低,敏感性差[6];γ-干擾素診斷法成本高,收集的血樣需短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行檢測;分子生物學(xué)檢測技術(shù)需要貴重的儀器設(shè)備,技術(shù)復(fù)雜,對實(shí)驗(yàn)室和操作人員的要求較高,這些診斷方法在牛結(jié)核病普查中難以應(yīng)用。

免疫層析技術(shù)(immunochromatographic assay,ICA)是20世紀(jì)90年代興起的一項(xiàng)免疫學(xué)檢測技術(shù),該技術(shù)特異性強(qiáng)、敏感性高,而且不需昂貴儀器設(shè)備,操作簡單快速,適合于基層獸醫(yī)檢測[7]。

MPB70、MPB83、ESAT-6是牛分支桿菌主要的特異性分泌抗原,應(yīng)用這些抗原檢測牛結(jié)核病具有很高的特異性,聯(lián)合使用時(shí)可以提高檢測的靈敏度[8-9]。本研究利用篩選出的 MPB70、MPB83、ESA T-6中的抗原表位經(jīng)原核表達(dá)的重組蛋白建立了一種檢測結(jié)核病的間接膠體金免疫層析法,該方法具有靈敏度高,特異性好等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原和血清 牛分支桿菌抗原蛋白MPB70-83-ESAT-6,由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室克隆、表達(dá)并提純和保存。金標(biāo)記兔抗牛IgG,購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。標(biāo)準(zhǔn)牛結(jié)核陽性血清,采自經(jīng)TST和細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)均為陽性的結(jié)核病牛。牛副結(jié)核病陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所?？谔阋吆团魅拘员菤夤苎钻栃匝鍨楹颖鞭r(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室保存。樣本血清,采自河北省多個(gè)奶牛場TST檢測后的奶牛。

1.1.2 主要試劑及材料 牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma公司;硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、樣品墊、吸收墊均購自上海金標(biāo)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測線抗原和質(zhì)控線抗體的包被 以原核表達(dá)并提純的重組蛋白MPB70-83-ESAT-6作為硝酸纖維素膜上的檢測線包被抗原。將蛋白MPB70-83-ESAT-6用 0.02 mol/L PBS(pH 7.4)稀釋至1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 m g/mL,置-20 ℃貯存?zhèn)溆?。鼠抗兔IgG作為硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線包被抗體。將稀釋后的MPB70-83-ESA T-6蛋白和鼠抗兔 IgG以每厘米0.80μL分別噴到黏附在PVP底板上的硝酸纖維素膜的檢測線和質(zhì)控線上,37℃烘干,室溫干燥貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 金標(biāo)墊的制備 將金標(biāo)記兔抗牛 IgG用Bio-Dot點(diǎn)膜儀以每厘米50μL的量噴到玻璃纖維素膜上,冷凍真空抽干后,室溫干燥貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 樣品墊的處理 將樣品墊浸泡于0.01 mo1/L pH 7.4磷酸緩沖液(20 g BSA,25 g海藻糖,3 g PVP-40,0.2 g NaN3,8 g NaCl,0.2 g KC l,2.9 g N a2HPO4·12H2O,0.2 g KH2PO4,用去離子水定容至1 000 mL)中30min后,于37℃烘干,真空封裝,置 4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 試紙條的組裝 如圖1所示,先將硝酸纖維素膜粘貼到PVP底板的相應(yīng)位置,然后將樣品墊,金標(biāo)墊,吸收墊依次粘貼到PVP底板的相應(yīng)位置,使金標(biāo)墊與吸收墊與硝酸纖維素膜部分接觸,將其切成4mm寬,室溫干燥貯存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 膠體金免疫層析試紙條的組裝示意圖Fig.1 The assembly of gold colloid imm unoch rom atographic strip

1.2.5 檢測方法及結(jié)果判定 取150μL待檢血清滴加在試紙條的加樣孔中,15 min內(nèi)讀取結(jié)果。檢測線和質(zhì)控線上均出現(xiàn)紅色條帶時(shí)判斷為陽性,質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶而檢測線上無條帶時(shí)判為陰性,如果質(zhì)控線上沒有條帶出現(xiàn)則檢測無效。

1.2.6 特異性檢驗(yàn) 用制備好的牛結(jié)核抗體檢測試紙條分別檢測牛結(jié)核陽性與陰性血清、牛副結(jié)核病、牛巴貝斯蟲病、?？谔阋吆团魅拘员菤夤苎钻栃匝?進(jìn)行試紙條特異性檢測。

1.2.7 敏感性檢驗(yàn) 將1份牛結(jié)核病陽性血清用生理鹽水倍比稀釋,用能檢測出陽性信號的血清最高稀釋倍數(shù)作為檢測敏感度。

1.2.8 臨床樣本檢測 按優(yōu)化的試驗(yàn)條件制備免疫膠體金試紙條,檢測285份血清樣本,同時(shí)與結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)(TST)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 檢測線抗原和質(zhì)控線抗原最佳包被濃度的確定

分別以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mg/mL 6種不同濃度的重組蛋白MPB70-83-ESAT-6包被硝酸纖維素膜上的檢測線,隨著抗原包被濃度的增加,檢測線的顏色逐漸加深,在到達(dá)2.5 mg/mL以后色澤不再加深(圖2),因此確定2.5 m g/mL為最佳抗原包被濃度。

2.2 試紙條特異性試驗(yàn)

用制備好的牛結(jié)核抗體檢測試紙條分別檢測牛結(jié)核病陽性血清和陰性血清、牛副結(jié)核病、牛巴貝斯病、口蹄疫和牛傳染性鼻氣管炎病陽性血清,該試紙條與牛結(jié)核病陽性血清作用檢測線出現(xiàn)明顯的紅色條帶,而與牛結(jié)核病陰性血清、牛副結(jié)核病、牛巴貝斯病、口蹄疫和牛傳染性鼻氣管炎病陽性血清作用檢測線未見紅色條帶(圖3),說明該試紙條具有良好的特異性。

2.3 試紙條敏感性試驗(yàn)

用研制的膠體金試紙條檢測1份倍比稀釋的牛結(jié)核病陽性血清,陽性血清最低檢出稀釋度為1∶640(圖4)。

2.4 臨床樣品檢測結(jié)果

用制備的牛結(jié)核病抗體快速檢測試紙條檢測285份經(jīng)TST檢測的奶牛的血清樣本,結(jié)果見表1。TST陽性牛18頭,其中試紙條檢出13份,陽性符合率為72.22%(13/18)。TST陰性牛267頭,其中試紙條檢測為陰性牛215頭,陰性符合率為80.52%(215/267)?？偡下蕿?0%(13+215/285)。說明膠體金試紙條與TST具有較高的符合率。

表1 制備的試紙條與TST的比較Table1 Comparison resu lts of the test strip w ith TST

圖2 不同濃度的重組蛋白包被的檢測線Fig.2 The coated detection line in different density of recombinant protein

圖3 試紙條特異性試驗(yàn)Fig.3 The specificity test of the strips

圖4 試紙條敏感性試驗(yàn)Fig.4 The sensitivity test of the strip s

3 討論

牛分支桿菌是典型的胞內(nèi)寄生菌,機(jī)體對其產(chǎn)生的免疫首先是細(xì)胞免疫,之后是體液免疫,二者是分離的。因此,基于細(xì)胞免疫的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)檢測方法(如TST),對感染后期的開放性結(jié)核及全身性結(jié)核不敏感,而此階段正是結(jié)核患牛散播病原的危險(xiǎn)時(shí)期?；隗w液免疫反應(yīng)的抗體檢測方法正好彌補(bǔ)了上述缺陷。牛分支桿菌感染機(jī)體后,在生長過程中能分泌多種抗原,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體,其抗體水平與疾病的病程呈正相關(guān)[10]。因此檢測血清中的IgG抗體的水平對于疾病的診斷有重要意義。

MPB70、MPB83是分支桿菌主要的特異性分泌抗原,可以刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng),而且引發(fā)體液免疫,具有免疫原性和免疫保護(hù)[11-12]。ESAT-6有多個(gè)T/B細(xì)胞表位,具有用于結(jié)核病早期診斷的發(fā)展前景[13-15]。這些蛋白都有用于診斷牛結(jié)核病的潛力,但在單獨(dú)使用時(shí)靈敏度較低,針對這一缺陷有人嘗試了聯(lián)合使用多種抗原的方法,使抗體檢測的靈敏度有了很大的提高,但該方法存在抗體配比不均和難于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的問題。本試驗(yàn)中所用的重組蛋白M PB70-83-ESAT-6是用 DNAstar對M PB70、MPB83、ESAT-6進(jìn)行分析后篩選的其中抗原性高的抗原表位連接后進(jìn)行表達(dá)和純化而得。試驗(yàn)中組裝的試紙條的敏感性試驗(yàn)表明,該重組蛋白對牛結(jié)核抗體的檢測有較高的靈敏度,同時(shí)也避免了聯(lián)合使用多種蛋白的配比不均的缺點(diǎn)。特異性試驗(yàn)顯示該試紙條不與牛副結(jié)核、牛巴貝斯病、口蹄疫和牛傳染性鼻氣管炎病陽性血清作用,具有很好的特異性。用制備的試紙條檢測285份牛血清并與TST進(jìn)行比較,結(jié)果顯示該試紙條與TST具有較高的符合率(80%),不同的檢測機(jī)制及牛感染分支桿菌后的先以細(xì)胞免疫為主后以體液免疫為主的特性致使TST與試紙條兩種檢測方法的符合率存在一定的差異。在TST檢測陰性試紙條檢測陽性的牛中,發(fā)現(xiàn)有3頭有明顯的咳嗽消瘦癥狀的牛,對其中一頭剖檢,發(fā)現(xiàn)了典型的結(jié)核病病理變化,進(jìn)一步證實(shí)試紙條更有利于檢出感染后期的結(jié)核病牛。因此,該試紙條可單獨(dú)用于牛結(jié)核病的檢疫,也可與TST結(jié)合使用使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

本試驗(yàn)建立了一種檢測牛結(jié)核抗體的免疫膠體金方法,該方法具有簡便、快速、特異、敏感等優(yōu)點(diǎn),可以對牛結(jié)核病進(jìn)行普查和檢疫,也可與TST結(jié)合使用以提高檢測的準(zhǔn)確率,具有良好的應(yīng)用前景。

[1]王忠仁.牛結(jié)核病與人結(jié)核病的相互關(guān)系[J].中國防癆雜志,2005,27,(5):123-125.

[2]Palmer M V,Waters W R,Thacker T C,et al.Effects of dif-ferent tubercu lin skin-testing regimens on gamma interferon andantibody responses in cattle experim entally infected with Mycobacterium bov is[J].C lin Vaccine Immunol,2006,13(3):387-394.

[3]Rua-domenech R,Goodchild A T,Vorderm ermeier H M,et al.A ntemortem diagnosis of tu rberculosis in cattle:A review of the tu rberculin tests,c-interferon assay and other ancillary diagnostic techniques[J].Resvet sci,2006,81:190-210.

[4]魯俊鵬,雛濰力,林彥星,等.牛結(jié)核病診斷方法研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(11):25-28.

[5]劉思國,王春來,宮 強(qiáng),等.牛分支桿菌特異性PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,28(1):81-83.

[6]王云霞,于三科,翟軍軍.牛結(jié)核病的現(xiàn)狀及診斷研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(6):38-41.

[7]王鳳強(qiáng),姜北宇,劉澤明,等.免疫膠體金快速診斷技術(shù)在獸醫(yī)診斷上的應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)雜志,2005,24(6):15-17.

[8]Cockle P J,Gordon SV,H ew inson RG,et al.Field evaluation of a novel differential diagnostic reagent for detection of Mycobacterium bovis in cattle[J].Clin Vaccine Immunol,2006,13(10):1119-1124.

[9]張桂榮,吳 波,晁彥杰,等.間接 ELISA檢測牛分枝桿菌抗體方法的建立及初步應(yīng)用[J]中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,29(7):555-560.

[10]Am adoriM,Lyashchenko K P,Gennaro mL,etal.Use of recom binant proteins in antibody tests for bovine tuberculosis[J].Vet M icrobiol,2002,85:379-389.

[11]Jiang X Y,Wang C F,Zhang P J,et al.C loning and ex pression of My cobacterium bovis secreted protein M PB83 in Escherichia coli[J].JBiochem M ol Biol,2006,39(1):22-25.

[12]欽 博,萬學(xué)濟(jì),胡巧云,等.牛型分支桿菌 MPB70蛋白膠乳凝集方法的建立及應(yīng)用[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,29(1):58-62.

[13]H arboe M,Malin A S,Dockrell H S,et al.B-Cell Epitopes and Quantification of the ESAT-6 Protein of M y cobacterium tubercu losis[J].In fect Imm un,1998,66(2):717-723.

[14]郭設(shè)平,劉思國,張秀華,等.牛分支桿菌抗原MPB70、MPB83和ESAT-6的融合表達(dá)及重組蛋白的初步應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,37(7):676-680.

[15]吳偉偉.牛結(jié)核分支桿菌ESAT-6基因克隆、表達(dá)及免疫活性研究[D].吉林長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,2007:52-66.