阮周曦,花群義*,楊俊興,曾少靈,曹琛福,秦智鋒,呂建強,林慶燕,周曉黎

(1.深圳出入境檢驗檢疫局,廣東深圳 518100;2.云南出入境檢驗檢疫局,云南昆明 650228)

隨著全球氣候的變化和生態(tài)環(huán)境的改變,藍舌病(Bluetongue,BLU)、鹿流行性出血熱病(Epizootic hemorrhagic disease of deer,EHD)、水皰性口炎(Vesicu lar stom atitis,VS)和赤羽病(Akabane,AKA)等4種動物蟲媒病在全球范圍內(nèi)大范圍流行和傳播,嚴重威脅著動物健康和畜牧業(yè)發(fā)展[1-4]。這4種疫病癥狀相似,需要進行實驗室鑒別診斷,而直接檢測病原的快速診斷方法在疫病防控中尤其能發(fā)揮重要作用。其常規(guī)的病原學診斷方法是病毒分離鑒定、免疫熒光標記抗體檢測和病毒核酸檢測等。但這些方法中,病毒分離鑒定方法操作費時費力且存在生物安全隱患,免疫熒光抗體方法存在敏感性低、特異性差,而目前的病毒核酸檢測方法只能進行單一疫病的檢測等局限性[5-6]。因此,建立一種針對BLU、VS、EHD和 AKA,在同一個反應管內(nèi)可同時對4種病毒進行快速鑒別檢測的多重RT-PCR方法,在臨床鑒別診斷和出入境動物檢疫中具有實用價值。多重RT-PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種可用于多種病原體檢測的技術(shù),其克服了單一RT-PCR在應對大量標本不同檢測對象時的費時費力的問題,不僅具有特異性強、敏感性高的特點,而且能在較短時間內(nèi)同時完成多種病毒的檢測,尤其適合于臨床上一些容易混淆又常常混合感染的疾病的鑒別診斷,是快速檢測和鑒別類似病原或者混合病原感染的有力工具。本研究建立了一種可用于上述4種動物蟲媒病病毒的多重RT-PCR檢測方法,為快速鑒別4種病毒提供重要檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 藍舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血熱病病毒(EHDV)、水皰性口炎病毒(VSV)和赤羽病病毒(AKV)4種無感染性病毒核酸(RNA)由深圳出入境檢驗檢疫局動檢實驗室課題組保存;豬水泡病病毒RNA和參考樣品由英國動物衛(wèi)生研究所Pirbright實驗室引進。FMDV O疫苗株從云南保山疫苗廠引進,由深圳出入境檢驗檢疫局動檢實驗室保存。

1.1.2 試劑 Total RNA提取試劑盒、Trizol Reagent購于美國Invitrogen公司;三氯甲烷、異丙醇、10 mm oL/L dNTP M ixture、25 mmoL/L M gCl2、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、40 U/μL RNase Inhibitor(RNA 酶抑制劑)、5×RT bu ffer、10 ×PCR buffer、150 bp DNA Ladder M arker、100 bp DNA Ladder Marker、RNA PCR K it(AMV)Ver3.0試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 引物設計及合成 根據(jù)基因庫提供的BTV、EHDV、VSV和AKV各基因的序列,通過Blast分析軟件分別對基因的序列進行分析,選擇了高度保守和特異性強的區(qū)段,應用Primer軟件設計多對引物,將合成的多對引物進行最佳配對篩選試驗,并經(jīng)過大量的反應條件優(yōu)選、對比試驗和驗證試驗,獲得了分別位于BTV VP7基因、EHDVVP7基因、VSV N基因及AKV N基因的4對引物。擴增長度 BTV 為 351 bp、EHDV 為 537 bp、VSV 為301 bp、AKV為250 bp。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。

表1 多重 RT-PCR引物設計結(jié)果Table1 Resultsof primers designed for multiplex RT-PCR

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取 參照文獻[5]的方法進行病毒RNA的提取。用核酸蛋白分析儀檢測RNA的純度和濃度,直接用于反轉(zhuǎn)錄或于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 cDNA的反轉(zhuǎn)錄 取200μL PCR反應管,反應總體積為20μL,RT 5×buffer 4μL,40 U/μL的RNA酶抑制劑1μL,10 mmoL/L dNTPs5μL,20μm ol/L的BTV、EHDV、VSV和AKV 下游引物各1μL,AM V(5 U/μL)逆轉(zhuǎn)錄酶1μL,模板 RNA 4μL,滅菌雙蒸水補足至 20μL。置室溫10min,42℃水浴60min,最后94℃5min滅活AMV逆轉(zhuǎn)錄酶,cDNA產(chǎn)物置冰盒冷卻備用。

1.2.3 多重RT-PCR體系的建立 PCR反應在帶熱蓋的Gene Amp PCR System 9700型中進行。分別將上述BTV、EHDV、VSV和AKV的cDNA產(chǎn)物作為模板,在管內(nèi)分別加入相對應的4對引物進行PCR擴增。反應體系為50μL:10×buffer 5μL,10 mmoL/L dNTP 4μL,25 mmoL/L M gCl2 3 μL,5 U Taq酶1μL,20μmol/L 的BTV 、EHDV、VSV和AKV上下游引物各1μL,4種病毒模板cDNA 5μL,加水補足50μL。PCR反應循環(huán)參數(shù)為:94℃預變性5 min;94℃45 s,55℃45 s,72℃1 min,30個循環(huán)。72℃延伸10 min,取10μL PCR產(chǎn)物在20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測,以Goldview染料替代EB,凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.4 多重RT-PCR最佳反應條件的優(yōu)化 參加PCR反應的5種重要成份即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+,建立一個良好的PCR反應體系必須進行引物、dNTP和Mg2+濃度的優(yōu)化。本試驗中,在初步的反應體系、反應條件和循環(huán)參數(shù)檢測出擴增條帶后,分別利用4種病毒各自的引物進行單項 RTPCR方法最佳引物濃度、最佳dNTPs濃度及最佳Mg2+濃度的測定。之后,以4種病毒混合液分別提取RNA,以最佳引物濃度、最佳dNTPs濃度及最佳Mg2+濃度,利用梯度PCR儀進行多重PCR方法最佳退火溫度的測定,確定最佳退火溫度后,以確定的最佳條件進行多重PCR方法最佳循環(huán)次數(shù)的測定,以篩選出多重 RT-PCR反應體系中最佳的反應模式。

1.2.5 多重RT-PCR的特異性試驗

1.2.5.1 單引物對4種病毒混合液擴增的特異性 為了驗證單引物的特異性,利用所選定的最佳反應條件,設計以下病毒樣品和單引物組合來進行單引物特異性試驗。采用4種病毒混合液總RNA與VPF/VPR引物液,4種病毒混合液總 RNA與BPF/BPR引物液,4種病毒混合液總RNA與EPF/EPR引物液,4種病毒混合液總RNA與APF/APR引物液,BHK 21細胞液總RNA與4種病毒各自的引物,分別進行RT-PCR,以檢測各自引物的特異性。

1.2.5.2 4對引物對單一病毒擴增的特異性 為了驗證利用4對引物進行多重RT-PCR時,相對應引物對各自病毒的特異性,用優(yōu)化的最佳反應條件,設計以下病毒樣品和多引物組合來進行多引物特異性試驗:BTV病毒液或BTV模板與4種引物混合液,EHDV病毒液與4種引物混合液,VSV病毒液與4種引物混合液,AKV病毒液與4種引物混合液,BHK-21細胞液總RNA與4種引物混合液,分別進行多重RT-PCR,以檢測多引物混合的特異性。

1.2.5.3 4對引物對4種病毒混合液擴增的特異性用優(yōu)化的最佳反應條件,以BTV、EHDV、VSV、AKV 4種病毒混合液與4對引物混合液,BHK-21細胞液總RNA與4種引物混合液,分別進行多重RT-PCR,以檢測4對引物對4種病毒混合液擴增的特異性。

1.2.5.4 4對引物對相關(guān)或相似病毒擴增的特異性采用優(yōu)化后的多重 RT-PCR最佳反應條件,用BTV 1、BTV 2、BTV 3、BTV 4、BTV 12、BTV 15、BTV 15 、EHDV 1 、EHDV 3 、EHDV 8 、VSV-NJ 、VSVIND 、AKV 、FMDV 、BVDV 、PPRV 、SVDV 的 RNA和BHK 21細胞總RNA為模板,用4種引物混合液進行多重PCR,以驗證多重RT-PCR的特異性。

1.2.6 多重 RT-PCR的敏感性試驗 將BTV、EHDV、VSV、AKV 4種病毒的總RNA混合液進行10倍系列稀釋,采用多重RT-PCR最佳反應條件進行擴增,以評估多重RT-PCR同時檢測4種病毒的敏感性。

1.2.7 PCR產(chǎn)物分析和測序 取10μL PCR產(chǎn)物在20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測,以Goldview染料或用含0.5μg/mL溴化乙錠染色。配膠及電泳緩沖液均為 1×TAE(0.04 moL/L,Tris-乙酸,0.001m oL/L EDTA,pH 8.8),120 V電泳40min,在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR產(chǎn)物在凝膠中的位置 ,用 150 bp DNA Ladder M arker、100 bp DNA Ladder M arker為參照判定結(jié)果。單引物RT-PCR產(chǎn)物回收純化后經(jīng)過與pMD18-T載體的連接反應(16℃連接30 min),然后將連接反應液熱轉(zhuǎn)化至E.coli JM 109感受態(tài)細胞,在含有 IPTG、X-Gal的L-Amp平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)。挑取白色菌落進行小量培養(yǎng),堿裂解法提取質(zhì)粒,送寶生物工程(大連)有限公司測序。所得的產(chǎn)物序列輸入 GenBank,用Blast進行同源性比對。

1.2.8 臨床樣品的檢測 將深圳出入境檢驗檢疫局動檢實驗室保存的BTV、EHDV、VSV、AKV臨床樣品共97份(其中 BTV樣品35份、EHDV樣品21份、VSV樣品9份、AKV樣品32份),分別進行 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、多重RT-PCR,并與相關(guān)國家標準或行業(yè)標準方法(GB/T18089-2008)、GB/T22916-2008、SN/T1128-2007)等檢測結(jié)果進行比較。

2 結(jié)果

2.1 最佳反應條件的優(yōu)化

經(jīng)過對 BTV、EHDV、VSV、AKV 共4對引物的最佳濃度、dNTP的最佳濃度、最佳退火溫度和最佳循環(huán)次數(shù)的測定,結(jié)果表明,在50μL反應體系中,以BTV的引物(BPF/BPR)最終濃度各為 25 pmol、EHDV的引物(EPF/EPR)最終濃度各為40 pmol、VSV的引物(VPF/VPR)最終濃度各為 20 pmol、AKV的引物(APF/APR)最終濃度各為25 pmol,dNTP濃度為400μmol/L,Mg2+濃度為250μmo l/L,最佳退火溫度為56℃,循環(huán)次數(shù)30次。在此反應條件下,PCR擴增效率高,產(chǎn)物量大,4種病毒的目的基因擴增條帶最清晰,無非特異性條帶出現(xiàn)。PCR反應循環(huán)參數(shù)為:94℃5min;94℃45 s,56℃45 s,72℃1min,30個循環(huán)。

2.2 單引物特異性擴增結(jié)果

4種病毒對應的特異性引物只能從病毒混合液中擴增出相應的病毒核酸。如BTV(351 bp),EHDV(537 bp),VSV(301 bp)and AKV(250 bp),而用4種引物混合液和各自的引物對BHK 21細胞液總RNA的擴增均為陰性,說明單引物擴增的特異性強。從圖1可見,4種病毒擴增的各個片段與預期設計的片段大小相符。對PCR擴增產(chǎn)物的克隆測序獲得的序列,經(jīng)DNA Star軟件分析,這些序列分別與參考序列一致。

2.3 多重RT-PCR特異性擴增結(jié)果

將4對特異性引物加入同一反應管內(nèi),以分別在每管加入VSV、BTV、EHDV和AKV的RNA模板,均只擴增出相應病毒目的基因的單一條帶,而在其中一管加入了4種病毒RNA,經(jīng)多重PCR可同時擴增出了 VSV(301 bp)、BTV(351 bp)、EHDV(537 bp)和AKV(250 bp)4條特異性片段,與預期大小一致。但對 FMDV、BVDV、PPRV、SVDV 的RNA和BHK 21的擴增結(jié)果均為陰性,沒有出現(xiàn)任何非特異性條帶,該多重RT-PCR方法的特異性好,結(jié)果見圖2。4種病毒對應4種引物出現(xiàn)了大小不同的4條目的條帶,單一引物對4種病毒混合模板的檢測結(jié)果只能檢測出引物相應的病毒目的基因,而對其他3種病毒的目的基因未能擴增,交叉使用引物或模板沒有目的條帶,4對引物之間沒有交叉反應。表明所建立的多重RT-PCR方法無論針對混合病毒模板還是單一病毒模板均可有效檢測特定病毒核酸,同時也說明所設計的引物特異性強。

2.4 多重RT-PCR敏感性試驗結(jié)果

以BTV、EHDV、VSV、AKV 共 4種病毒的BHK 21細胞培養(yǎng)物為檢測對象,各取250μL混合,提取總 RNA 后,系列稀釋成 100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,以 4 種病毒的 4 對引物混合液對其進行多重PCR擴增檢測,每個稀釋度同時做3個重復試驗。結(jié)果4種病毒均可檢測到稀釋成10-7的樣品,結(jié)果如圖3。

2.5 多重RT-PCR對各血清型病毒的檢測結(jié)果

為確定4種特異性引物對相應病毒各型或病毒株的檢測特異性和通用性,分別以BTV 1型～BTV 24型、EHDV 1型 ～EHDV 8型、VSV-N J型、VSV-IND型、3株AKV病毒的 RNA為模板,用4種引物混合液分別進行多重 RT-PCR擴增,表明BTV、EHDV、VSV和AKV的特異性引物分別對相應的 BTV 1型 ～BTV 24型病毒、EHDV 1型 ～EHDV 8型病毒、VSV-NJ型和VSV-IND型病毒以及AKV病毒的檢測均獲得陽性結(jié)果。如圖4為VSV和AKV RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果,圖5為EHDV擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果。

2.6 對樣品的檢測與評估

應用多重RT-PCR對深圳出入境檢驗檢疫局動檢實驗室保存的 97份 BTV、EHDV、VSV、AKV 4種病毒細胞和組織樣品進行檢測,結(jié)果BTV樣品16份、EHDV 樣品 13份、VSV 樣品 4份 、AKV 樣品5份檢出陽性,與相關(guān)國家標準或行業(yè)標準方法(GB/T18089-2008)、GB/T22916-2008、SN/T1128-2007)等檢測結(jié)果一致。

圖3 VSV、BTV、EHDV和 AKV多重RT-PCR敏感性Fig.3 Sensitivity ofmultiplex RT-PCR for the detection of four genusarboviruses

圖4 VSV和 AKV RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳 Fig.4 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR am plification products for VSV and AKV

圖5 EHDV 1-8型RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR amplification products for EHDV 1-8

3 討論

藍舌病、水皰性口炎、鹿流行性出血熱病和赤羽病是4種重要的動物蟲媒病,是出入境動物檢驗檢疫中重要的檢疫對象,近年來在一些國家和地區(qū)流行和傳播,造成重大經(jīng)濟損失[7]。由于這4種病毒的自然宿主和傳播媒介相同或者類似,臨床癥狀也大致相同,因此,建立同時可檢測這4種病毒的快速檢測方法可顯著提高檢測效率,對于出入境口岸動物檢疫具有重要的應用價值。

多重RT-PCR是在同一反應體系中加入多對引物對不同病毒核酸的目的片段進行特異性擴增,影響其擴增效果的因素比只有一對引物的擴增體系要多,反應體系中各物質(zhì)的濃度及擴增條件直接影響試驗效果[8-9]。因此,本試驗中對反應體系和條件分別進行了優(yōu)化,以確保在最少的成本和時間下,4種病毒目的基因擴增的效率均最高。在多重RT-PCR體系的優(yōu)化過程中,在初步的反應體系、反應條件和循環(huán)參數(shù)檢測出擴增條帶后,先后對引物濃度、dNTPs濃度和Mg2+濃度進行了反復摸索,獲得的反應體系可對BTV、EHDV、VSV和AKV不同血清型和毒株能特異性擴增,具有廣泛的適用性,而對FMDV、BVDV、PPRV 、SVDV 的 RNA 和 BHK 21細胞總RNA的擴增結(jié)果均為陰性,沒有出現(xiàn)任何條帶。由于4種病毒各自引物的最佳反應溫度有差異,使得在最初采用單一退火溫度進行多重RTPCR時,得到的擴增結(jié)果從亮度及擴增結(jié)果的穩(wěn)定性方面都不是很理想。因此,在對擴增條件的優(yōu)化中,主要針對退火溫度進行。在4種病毒單一 RTPCR條件的基礎(chǔ)上,采用梯度PCR儀,退火溫度確定為56℃,擴增條件以94℃5min;94℃45 s,56℃45 s,72℃1min,30個循環(huán);然后72℃延伸5min,經(jīng)電泳檢測,4種病毒目的基因擴增均獲得了均一、穩(wěn)定的預期特異性擴增產(chǎn)物。

考慮到理論上多重RT-PCR的敏感性和特異性較單一RT-PCR法會有所下降[10-11]。為了盡量克服這一缺點,在引物設計時首先對4種病毒相關(guān)的病毒屬成員的基因組序列進行同源性比較,選擇BTV、EHDV、VSV和AKV高度保守且特異性強的區(qū)段來設計多套多重RT-PCR引物,并進一步經(jīng)過Blast同源性分析,以保證引物擴增的特異性。將合成的多對引物進行最佳配對篩選試驗,并經(jīng)過大量的反應條件優(yōu)選和驗證試驗,獲得了分別位于BTV VP7基因、EHDV VP7基因、VSV N 基因及AKV N基因的4對引物,其對4種病毒檢測的擴增效率高和特異性好,且每對引物擴增的片段長度之間相差超過50 bp,使多重RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測時更簡便直觀,對4種病毒的鑒別檢測或混合感染疑似病例的診斷更加方便快速。

利用4種病毒各自的引物分別檢測四種病毒的混合液樣品,結(jié)果單一引物對4種病毒混合模板的檢測時,只能檢測出引物相應的病毒目的基因,而對其他3種病毒的目的基因未能擴增。在單對引物擴增條件的基礎(chǔ)上,采用經(jīng)過優(yōu)化的多重RT-PCR反應條件,將4對特異性引物加入同一反應管內(nèi),以分別在每管加入VSV、BTV、EHDV和AKV的RNA模板,均只擴增出相應病毒目的基因的單一條帶,而在其中一管加入了4種病毒RNA,經(jīng)多重RT-PCR可同時擴增出了相應的大小不同的4條目的條帶,且與預期大小一致,說明在同一體系內(nèi)同時檢測4種病毒是可行的。但對 FMDV、BVDV、PPRV、SVDV的RNA和BHK-21細胞總 RNA的擴增結(jié)果均為陰性,沒有出現(xiàn)任何條帶,4對引物之間沒有交叉反應,該多重RT-PCR方法的特異性好。這表明所建立的多重RT-PCR法無論針對混合病毒模板還是單一病毒模板均可有效檢測特定病毒核酸。將4種病毒混合液提取RNA后作10倍系列稀釋后,進行檢測,BTV、EHDV、VSV和AKV引物的靈敏度均可達到了10-7,顯示了較高的靈敏度。在多重RT-PCR對4種病毒的各血清型或病毒株的檢測試驗表明,4種特異性引物對相應病毒各型的檢測具有特異性和通用性。因此,該研究建立的多重 RTPCR方法在4種疫病的鑒別診斷和動物檢疫方面具有廣闊的應用前景。

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