阮周曦,花群義*,楊俊興,曾少靈,曹琛福,秦智鋒,呂建強(qiáng),林慶燕,周曉黎

(1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東深圳 518100;2.云南出入境檢驗(yàn)檢疫局,云南昆明 650228)

隨著全球氣候的變化和生態(tài)環(huán)境的改變,藍(lán)舌病(Bluetongue,BLU)、鹿流行性出血熱病(Epizootic hemorrhagic disease of deer,EHD)、水皰性口炎(Vesicu lar stom atitis,VS)和赤羽病(Akabane,AKA)等4種動(dòng)物蟲媒病在全球范圍內(nèi)大范圍流行和傳播,嚴(yán)重威脅著動(dòng)物健康和畜牧業(yè)發(fā)展[1-4]。這4種疫病癥狀相似,需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室鑒別診斷,而直接檢測(cè)病原的快速診斷方法在疫病防控中尤其能發(fā)揮重要作用。其常規(guī)的病原學(xué)診斷方法是病毒分離鑒定、免疫熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)和病毒核酸檢測(cè)等。但這些方法中,病毒分離鑒定方法操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力且存在生物安全隱患,免疫熒光抗體方法存在敏感性低、特異性差,而目前的病毒核酸檢測(cè)方法只能進(jìn)行單一疫病的檢測(cè)等局限性[5-6]。因此,建立一種針對(duì)BLU、VS、EHD和 AKA,在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)可同時(shí)對(duì)4種病毒進(jìn)行快速鑒別檢測(cè)的多重RT-PCR方法,在臨床鑒別診斷和出入境動(dòng)物檢疫中具有實(shí)用價(jià)值。多重RT-PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種可用于多種病原體檢測(cè)的技術(shù),其克服了單一RT-PCR在應(yīng)對(duì)大量標(biāo)本不同檢測(cè)對(duì)象時(shí)的費(fèi)時(shí)費(fèi)力的問題,不僅具有特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn),而且能在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)完成多種病毒的檢測(cè),尤其適合于臨床上一些容易混淆又常常混合感染的疾病的鑒別診斷,是快速檢測(cè)和鑒別類似病原或者混合病原感染的有力工具。本研究建立了一種可用于上述4種動(dòng)物蟲媒病病毒的多重RT-PCR檢測(cè)方法,為快速鑒別4種病毒提供重要檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 藍(lán)舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血熱病病毒(EHDV)、水皰性口炎病毒(VSV)和赤羽病病毒(AKV)4種無(wú)感染性病毒核酸(RNA)由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室課題組保存;豬水泡病病毒RNA和參考樣品由英國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生研究所Pirbright實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)。FMDV O疫苗株從云南保山疫苗廠引進(jìn),由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 Total RNA提取試劑盒、Trizol Reagent購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;三氯甲烷、異丙醇、10 mm oL/L dNTP M ixture、25 mmoL/L M gCl2、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、40 U/μL RNase Inhibitor(RNA 酶抑制劑)、5×RT bu ffer、10 ×PCR buffer、150 bp DNA Ladder M arker、100 bp DNA Ladder Marker、RNA PCR K it(AMV)Ver3.0試劑盒等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)基因庫(kù)提供的BTV、EHDV、VSV和AKV各基因的序列,通過Blast分析軟件分別對(duì)基因的序列進(jìn)行分析,選擇了高度保守和特異性強(qiáng)的區(qū)段,應(yīng)用Primer軟件設(shè)計(jì)多對(duì)引物,將合成的多對(duì)引物進(jìn)行最佳配對(duì)篩選試驗(yàn),并經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對(duì)比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn),獲得了分別位于BTV VP7基因、EHDVVP7基因、VSV N基因及AKV N基因的4對(duì)引物。擴(kuò)增長(zhǎng)度 BTV 為 351 bp、EHDV 為 537 bp、VSV 為301 bp、AKV為250 bp。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。

表1 多重 RT-PCR引物設(shè)計(jì)結(jié)果Table1 Resultsof primers designed for multiplex RT-PCR

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取 參照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行病毒RNA的提取。用核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA的純度和濃度,直接用于反轉(zhuǎn)錄或于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 cDNA的反轉(zhuǎn)錄 取200μL PCR反應(yīng)管,反應(yīng)總體積為20μL,RT 5×buffer 4μL,40 U/μL的RNA酶抑制劑1μL,10 mmoL/L dNTPs5μL,20μm ol/L的BTV、EHDV、VSV和AKV 下游引物各1μL,AM V(5 U/μL)逆轉(zhuǎn)錄酶1μL,模板 RNA 4μL,滅菌雙蒸水補(bǔ)足至 20μL。置室溫10min,42℃水浴60min,最后94℃5min滅活A(yù)MV逆轉(zhuǎn)錄酶,cDNA產(chǎn)物置冰盒冷卻備用。

1.2.3 多重RT-PCR體系的建立 PCR反應(yīng)在帶熱蓋的Gene Amp PCR System 9700型中進(jìn)行。分別將上述BTV、EHDV、VSV和AKV的cDNA產(chǎn)物作為模板,在管內(nèi)分別加入相對(duì)應(yīng)的4對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50μL:10×buffer 5μL,10 mmoL/L dNTP 4μL,25 mmoL/L M gCl2 3 μL,5 U Taq酶1μL,20μmol/L 的BTV 、EHDV、VSV和AKV上下游引物各1μL,4種病毒模板cDNA 5μL,加水補(bǔ)足50μL。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性5 min;94℃45 s,55℃45 s,72℃1 min,30個(gè)循環(huán)。72℃延伸10 min,取10μL PCR產(chǎn)物在20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),以Goldview染料替代EB,凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.4 多重RT-PCR最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化 參加PCR反應(yīng)的5種重要成份即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+,建立一個(gè)良好的PCR反應(yīng)體系必須進(jìn)行引物、dNTP和Mg2+濃度的優(yōu)化。本試驗(yàn)中,在初步的反應(yīng)體系、反應(yīng)條件和循環(huán)參數(shù)檢測(cè)出擴(kuò)增條帶后,分別利用4種病毒各自的引物進(jìn)行單項(xiàng) RTPCR方法最佳引物濃度、最佳dNTPs濃度及最佳Mg2+濃度的測(cè)定。之后,以4種病毒混合液分別提取RNA,以最佳引物濃度、最佳dNTPs濃度及最佳Mg2+濃度,利用梯度PCR儀進(jìn)行多重PCR方法最佳退火溫度的測(cè)定,確定最佳退火溫度后,以確定的最佳條件進(jìn)行多重PCR方法最佳循環(huán)次數(shù)的測(cè)定,以篩選出多重 RT-PCR反應(yīng)體系中最佳的反應(yīng)模式。

1.2.5 多重RT-PCR的特異性試驗(yàn)

1.2.5.1 單引物對(duì)4種病毒混合液擴(kuò)增的特異性 為了驗(yàn)證單引物的特異性,利用所選定的最佳反應(yīng)條件,設(shè)計(jì)以下病毒樣品和單引物組合來(lái)進(jìn)行單引物特異性試驗(yàn)。采用4種病毒混合液總RNA與VPF/VPR引物液,4種病毒混合液總 RNA與BPF/BPR引物液,4種病毒混合液總RNA與EPF/EPR引物液,4種病毒混合液總RNA與APF/APR引物液,BHK 21細(xì)胞液總RNA與4種病毒各自的引物,分別進(jìn)行RT-PCR,以檢測(cè)各自引物的特異性。

1.2.5.2 4對(duì)引物對(duì)單一病毒擴(kuò)增的特異性 為了驗(yàn)證利用4對(duì)引物進(jìn)行多重RT-PCR時(shí),相對(duì)應(yīng)引物對(duì)各自病毒的特異性,用優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件,設(shè)計(jì)以下病毒樣品和多引物組合來(lái)進(jìn)行多引物特異性試驗(yàn):BTV病毒液或BTV模板與4種引物混合液,EHDV病毒液與4種引物混合液,VSV病毒液與4種引物混合液,AKV病毒液與4種引物混合液,BHK-21細(xì)胞液總RNA與4種引物混合液,分別進(jìn)行多重RT-PCR,以檢測(cè)多引物混合的特異性。

1.2.5.3 4對(duì)引物對(duì)4種病毒混合液擴(kuò)增的特異性用優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件,以BTV、EHDV、VSV、AKV 4種病毒混合液與4對(duì)引物混合液,BHK-21細(xì)胞液總RNA與4種引物混合液,分別進(jìn)行多重RT-PCR,以檢測(cè)4對(duì)引物對(duì)4種病毒混合液擴(kuò)增的特異性。

1.2.5.4 4對(duì)引物對(duì)相關(guān)或相似病毒擴(kuò)增的特異性采用優(yōu)化后的多重 RT-PCR最佳反應(yīng)條件,用BTV 1、BTV 2、BTV 3、BTV 4、BTV 12、BTV 15、BTV 15 、EHDV 1 、EHDV 3 、EHDV 8 、VSV-NJ 、VSVIND 、AKV 、FMDV 、BVDV 、PPRV 、SVDV 的 RNA和BHK 21細(xì)胞總RNA為模板,用4種引物混合液進(jìn)行多重PCR,以驗(yàn)證多重RT-PCR的特異性。

1.2.6 多重 RT-PCR的敏感性試驗(yàn) 將BTV、EHDV、VSV、AKV 4種病毒的總RNA混合液進(jìn)行10倍系列稀釋,采用多重RT-PCR最佳反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增,以評(píng)估多重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)4種病毒的敏感性。

1.2.7 PCR產(chǎn)物分析和測(cè)序 取10μL PCR產(chǎn)物在20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),以Goldview染料或用含0.5μg/mL溴化乙錠染色。配膠及電泳緩沖液均為 1×TAE(0.04 moL/L,Tris-乙酸,0.001m oL/L EDTA,pH 8.8),120 V電泳40min,在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR產(chǎn)物在凝膠中的位置 ,用 150 bp DNA Ladder M arker、100 bp DNA Ladder M arker為參照判定結(jié)果。單引物RT-PCR產(chǎn)物回收純化后經(jīng)過與pMD18-T載體的連接反應(yīng)(16℃連接30 min),然后將連接反應(yīng)液熱轉(zhuǎn)化至E.coli JM 109感受態(tài)細(xì)胞,在含有 IPTG、X-Gal的L-Amp平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)。挑取白色菌落進(jìn)行小量培養(yǎng),堿裂解法提取質(zhì)粒,送寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。所得的產(chǎn)物序列輸入 GenBank,用Blast進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.2.8 臨床樣品的檢測(cè) 將深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存的BTV、EHDV、VSV、AKV臨床樣品共97份(其中 BTV樣品35份、EHDV樣品21份、VSV樣品9份、AKV樣品32份),分別進(jìn)行 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、多重RT-PCR,并與相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法(GB/T18089-2008)、GB/T22916-2008、SN/T1128-2007)等檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化

經(jīng)過對(duì) BTV、EHDV、VSV、AKV 共4對(duì)引物的最佳濃度、dNTP的最佳濃度、最佳退火溫度和最佳循環(huán)次數(shù)的測(cè)定,結(jié)果表明,在50μL反應(yīng)體系中,以BTV的引物(BPF/BPR)最終濃度各為 25 pmol、EHDV的引物(EPF/EPR)最終濃度各為40 pmol、VSV的引物(VPF/VPR)最終濃度各為 20 pmol、AKV的引物(APF/APR)最終濃度各為25 pmol,dNTP濃度為400μmol/L,Mg2+濃度為250μmo l/L,最佳退火溫度為56℃,循環(huán)次數(shù)30次。在此反應(yīng)條件下,PCR擴(kuò)增效率高,產(chǎn)物量大,4種病毒的目的基因擴(kuò)增條帶最清晰,無(wú)非特異性條帶出現(xiàn)。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為:94℃5min;94℃45 s,56℃45 s,72℃1min,30個(gè)循環(huán)。

2.2 單引物特異性擴(kuò)增結(jié)果

4種病毒對(duì)應(yīng)的特異性引物只能從病毒混合液中擴(kuò)增出相應(yīng)的病毒核酸。如BTV(351 bp),EHDV(537 bp),VSV(301 bp)and AKV(250 bp),而用4種引物混合液和各自的引物對(duì)BHK 21細(xì)胞液總RNA的擴(kuò)增均為陰性,說(shuō)明單引物擴(kuò)增的特異性強(qiáng)。從圖1可見,4種病毒擴(kuò)增的各個(gè)片段與預(yù)期設(shè)計(jì)的片段大小相符。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆測(cè)序獲得的序列,經(jīng)DNA Star軟件分析,這些序列分別與參考序列一致。

2.3 多重RT-PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果

將4對(duì)特異性引物加入同一反應(yīng)管內(nèi),以分別在每管加入VSV、BTV、EHDV和AKV的RNA模板,均只擴(kuò)增出相應(yīng)病毒目的基因的單一條帶,而在其中一管加入了4種病毒RNA,經(jīng)多重PCR可同時(shí)擴(kuò)增出了 VSV(301 bp)、BTV(351 bp)、EHDV(537 bp)和AKV(250 bp)4條特異性片段,與預(yù)期大小一致。但對(duì) FMDV、BVDV、PPRV、SVDV 的RNA和BHK 21的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性,沒有出現(xiàn)任何非特異性條帶,該多重RT-PCR方法的特異性好,結(jié)果見圖2。4種病毒對(duì)應(yīng)4種引物出現(xiàn)了大小不同的4條目的條帶,單一引物對(duì)4種病毒混合模板的檢測(cè)結(jié)果只能檢測(cè)出引物相應(yīng)的病毒目的基因,而對(duì)其他3種病毒的目的基因未能擴(kuò)增,交叉使用引物或模板沒有目的條帶,4對(duì)引物之間沒有交叉反應(yīng)。表明所建立的多重RT-PCR方法無(wú)論針對(duì)混合病毒模板還是單一病毒模板均可有效檢測(cè)特定病毒核酸,同時(shí)也說(shuō)明所設(shè)計(jì)的引物特異性強(qiáng)。

2.4 多重RT-PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

以BTV、EHDV、VSV、AKV 共 4種病毒的BHK 21細(xì)胞培養(yǎng)物為檢測(cè)對(duì)象,各取250μL混合,提取總 RNA 后,系列稀釋成 100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,以 4 種病毒的 4 對(duì)引物混合液對(duì)其進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增檢測(cè),每個(gè)稀釋度同時(shí)做3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果4種病毒均可檢測(cè)到稀釋成10-7的樣品,結(jié)果如圖3。

2.5 多重RT-PCR對(duì)各血清型病毒的檢測(cè)結(jié)果

為確定4種特異性引物對(duì)相應(yīng)病毒各型或病毒株的檢測(cè)特異性和通用性,分別以BTV 1型～BTV 24型、EHDV 1型 ～EHDV 8型、VSV-N J型、VSV-IND型、3株AKV病毒的 RNA為模板,用4種引物混合液分別進(jìn)行多重 RT-PCR擴(kuò)增,表明BTV、EHDV、VSV和AKV的特異性引物分別對(duì)相應(yīng)的 BTV 1型 ～BTV 24型病毒、EHDV 1型 ～EHDV 8型病毒、VSV-NJ型和VSV-IND型病毒以及AKV病毒的檢測(cè)均獲得陽(yáng)性結(jié)果。如圖4為VSV和AKV RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果,圖5為EHDV擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。

2.6 對(duì)樣品的檢測(cè)與評(píng)估

應(yīng)用多重RT-PCR對(duì)深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存的 97份 BTV、EHDV、VSV、AKV 4種病毒細(xì)胞和組織樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果BTV樣品16份、EHDV 樣品 13份、VSV 樣品 4份 、AKV 樣品5份檢出陽(yáng)性,與相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法(GB/T18089-2008)、GB/T22916-2008、SN/T1128-2007)等檢測(cè)結(jié)果一致。

圖3 VSV、BTV、EHDV和 AKV多重RT-PCR敏感性Fig.3 Sensitivity ofmultiplex RT-PCR for the detection of four genusarboviruses

圖4 VSV和 AKV RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳 Fig.4 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR am plification products for VSV and AKV

圖5 EHDV 1-8型RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR amplification products for EHDV 1-8

3 討論

藍(lán)舌病、水皰性口炎、鹿流行性出血熱病和赤羽病是4種重要的動(dòng)物蟲媒病,是出入境動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫中重要的檢疫對(duì)象,近年來(lái)在一些國(guó)家和地區(qū)流行和傳播,造成重大經(jīng)濟(jì)損失[7]。由于這4種病毒的自然宿主和傳播媒介相同或者類似,臨床癥狀也大致相同,因此,建立同時(shí)可檢測(cè)這4種病毒的快速檢測(cè)方法可顯著提高檢測(cè)效率,對(duì)于出入境口岸動(dòng)物檢疫具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

多重RT-PCR是在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物對(duì)不同病毒核酸的目的片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增,影響其擴(kuò)增效果的因素比只有一對(duì)引物的擴(kuò)增體系要多,反應(yīng)體系中各物質(zhì)的濃度及擴(kuò)增條件直接影響試驗(yàn)效果[8-9]。因此,本試驗(yàn)中對(duì)反應(yīng)體系和條件分別進(jìn)行了優(yōu)化,以確保在最少的成本和時(shí)間下,4種病毒目的基因擴(kuò)增的效率均最高。在多重RT-PCR體系的優(yōu)化過程中,在初步的反應(yīng)體系、反應(yīng)條件和循環(huán)參數(shù)檢測(cè)出擴(kuò)增條帶后,先后對(duì)引物濃度、dNTPs濃度和Mg2+濃度進(jìn)行了反復(fù)摸索,獲得的反應(yīng)體系可對(duì)BTV、EHDV、VSV和AKV不同血清型和毒株能特異性擴(kuò)增,具有廣泛的適用性,而對(duì)FMDV、BVDV、PPRV 、SVDV 的 RNA 和 BHK 21細(xì)胞總RNA的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性,沒有出現(xiàn)任何條帶。由于4種病毒各自引物的最佳反應(yīng)溫度有差異,使得在最初采用單一退火溫度進(jìn)行多重RTPCR時(shí),得到的擴(kuò)增結(jié)果從亮度及擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定性方面都不是很理想。因此,在對(duì)擴(kuò)增條件的優(yōu)化中,主要針對(duì)退火溫度進(jìn)行。在4種病毒單一 RTPCR條件的基礎(chǔ)上,采用梯度PCR儀,退火溫度確定為56℃,擴(kuò)增條件以94℃5min;94℃45 s,56℃45 s,72℃1min,30個(gè)循環(huán);然后72℃延伸5min,經(jīng)電泳檢測(cè),4種病毒目的基因擴(kuò)增均獲得了均一、穩(wěn)定的預(yù)期特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

考慮到理論上多重RT-PCR的敏感性和特異性較單一RT-PCR法會(huì)有所下降[10-11]。為了盡量克服這一缺點(diǎn),在引物設(shè)計(jì)時(shí)首先對(duì)4種病毒相關(guān)的病毒屬成員的基因組序列進(jìn)行同源性比較,選擇BTV、EHDV、VSV和AKV高度保守且特異性強(qiáng)的區(qū)段來(lái)設(shè)計(jì)多套多重RT-PCR引物,并進(jìn)一步經(jīng)過Blast同源性分析,以保證引物擴(kuò)增的特異性。將合成的多對(duì)引物進(jìn)行最佳配對(duì)篩選試驗(yàn),并經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選和驗(yàn)證試驗(yàn),獲得了分別位于BTV VP7基因、EHDV VP7基因、VSV N 基因及AKV N基因的4對(duì)引物,其對(duì)4種病毒檢測(cè)的擴(kuò)增效率高和特異性好,且每對(duì)引物擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度之間相差超過50 bp,使多重RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)更簡(jiǎn)便直觀,對(duì)4種病毒的鑒別檢測(cè)或混合感染疑似病例的診斷更加方便快速。

利用4種病毒各自的引物分別檢測(cè)四種病毒的混合液樣品,結(jié)果單一引物對(duì)4種病毒混合模板的檢測(cè)時(shí),只能檢測(cè)出引物相應(yīng)的病毒目的基因,而對(duì)其他3種病毒的目的基因未能擴(kuò)增。在單對(duì)引物擴(kuò)增條件的基礎(chǔ)上,采用經(jīng)過優(yōu)化的多重RT-PCR反應(yīng)條件,將4對(duì)特異性引物加入同一反應(yīng)管內(nèi),以分別在每管加入VSV、BTV、EHDV和AKV的RNA模板,均只擴(kuò)增出相應(yīng)病毒目的基因的單一條帶,而在其中一管加入了4種病毒RNA,經(jīng)多重RT-PCR可同時(shí)擴(kuò)增出了相應(yīng)的大小不同的4條目的條帶,且與預(yù)期大小一致,說(shuō)明在同一體系內(nèi)同時(shí)檢測(cè)4種病毒是可行的。但對(duì) FMDV、BVDV、PPRV、SVDV的RNA和BHK-21細(xì)胞總 RNA的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性,沒有出現(xiàn)任何條帶,4對(duì)引物之間沒有交叉反應(yīng),該多重RT-PCR方法的特異性好。這表明所建立的多重RT-PCR法無(wú)論針對(duì)混合病毒模板還是單一病毒模板均可有效檢測(cè)特定病毒核酸。將4種病毒混合液提取RNA后作10倍系列稀釋后,進(jìn)行檢測(cè),BTV、EHDV、VSV和AKV引物的靈敏度均可達(dá)到了10-7,顯示了較高的靈敏度。在多重RT-PCR對(duì)4種病毒的各血清型或病毒株的檢測(cè)試驗(yàn)表明,4種特異性引物對(duì)相應(yīng)病毒各型的檢測(cè)具有特異性和通用性。因此,該研究建立的多重 RTPCR方法在4種疫病的鑒別診斷和動(dòng)物檢疫方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

[1]M ertens P P,M aan N S,Prasad G,et al.Design of p rim ers and use of RT-PCR assay s for typing Eu ropean bluetongue virus isolates:differentiation of field and vaccine strains[J].J Gen V irol,2007,88(10):2811-2823.

[2]A radaib I E,Sm ith W L,Osburn B I,et al.A mu ltiplex PCR for sim ultaneous detection and differentiation of North American seroty pes of bluetongue and epizootic hemorrhagic disease viruses[J].Comp Immunol M icrobiol Infect Dis,2003,26(2):77-87.

[3]Akashi H,Onuma S,Nagano H,et al.Detection and differentiation of A ino and Akabane Sim bu serogroup bunyaviruses by nested polymerase chain reaction[J].A rch Virol,1999,144(11):2101-2109.

[4]Rodriguez L L,Lecthw orth G J,Nichol S T.Rapid detection of vesicular stomatitis virus New Jersey serotype in clinical sam ples by using polymerase chain reaction[J].JClin m icrobial,1993,31:2016-2020.

[5]鐘金棟,花群義,肖榮海,等.多重PCR同時(shí)檢測(cè)口蹄疫病毒、豬水皰病病毒和水皰性口炎病毒[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(7):55-58.

[6]Johnson D J,W ilson W C,Paul P S,et al.Validation of a reverse transcriptasemultiplex PCR test for the serotypedetermination of U.S.isolates of b luetongue virus[J].Vet M icrobiol,2000,76(2):105-115.

[7]An t hony S,Jones H,Darpel K E,et al.A duplex RT-PCR assay for detection of genome segment 7(VP7 gene)from 24 BTV serotypes[J].JV irol Meth,2007,141(2):188-219.

[8]A radaib IE,Mohamed E H,Abdalla TM,et al.Serogrouping of United States and some A frican serotypes of bluetongue virususing RT-PCR[J].Vet M icrobiol,2005,111(324):1452-1500.

[9]黃良宗,冼瓊珍,顧萬(wàn)軍,等.多重PCR檢測(cè)豬偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬流感病毒[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(7):62-65.

[10]余麗蕓,劉建柱,侯喜林,等.多重PCR檢測(cè)豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病病毒的研究——豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病病毒多重PCR引物設(shè)計(jì)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2004,25(6):75-77.

[11]郭 巍,戴伶俐,李雪峰,等.馬流感病毒多重 RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,29(11):28-31.