法 蕓, 張 聰, 楊海燕, 包 艷, 秦 勇

（中國(guó)科學(xué)院 青島生物能源與過(guò)程研究所 生物液體燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266101）

離子色譜法同時(shí)測(cè)定嗜熱厭氧菌發(fā)酵液中的有機(jī)酸與無(wú)機(jī)陰離子

法 蕓, 張 聰, 楊海燕, 包 艷, 秦 勇

（中國(guó)科學(xué)院 青島生物能源與過(guò)程研究所 生物液體燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266101）

建立了一種利用離子色譜法同時(shí)測(cè)定甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、丁酸5種有機(jī)酸及PO4?3、SO4?2、NO3?、Cl?、F?5種無(wú)機(jī)陰離子的方法。樣品通過(guò)過(guò)濾、預(yù)柱處理后用IonPac AS11柱分離, 以自動(dòng)淋洗液發(fā)生器生成的KOH為淋洗液進(jìn)行梯度洗脫, 建立了優(yōu)化的洗脫程序。用抑制型電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)有機(jī)酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.73%～1.01%, 加標(biāo)回收率為88.1%～100.2%; 無(wú)機(jī)陰離子的平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.03%, 加標(biāo)回收率為 92.6%～101.1%, 該方法可用于嗜熱厭氧菌發(fā)酵液中低分子的有機(jī)酸和無(wú)機(jī)陰離子的同時(shí)測(cè)定。

離子色譜法; 梯度洗脫; 有機(jī)酸; 發(fā)酵液

近年來(lái)細(xì)胞的新陳代謝和通量研究已被廣泛關(guān)注[1～3], 通過(guò)分析細(xì)胞代謝物的某些成分, 特別是重要代謝物成分的檢測(cè), 對(duì)準(zhǔn)確地闡明新陳代謝的途徑有著非常重要的意義[4]。同時(shí)可為合理地設(shè)計(jì)目標(biāo)微生物提供有力的技術(shù)支持。

熱纖梭菌是嗜熱產(chǎn)芽孢的嚴(yán)格厭氧菌, 它是目前將纖維素直接轉(zhuǎn)化為乙醇的最有效菌種, 因而引起眾多生物能源研究者的關(guān)注。乙酸、乳酸等有機(jī)酸是熱纖梭菌發(fā)酵后的重要代謝產(chǎn)物。通過(guò)對(duì)乙酸、乳酸等小分子質(zhì)量有機(jī)酸的測(cè)定, 可為闡明熱纖梭菌發(fā)酵的代謝途徑提供有力的技術(shù)支持。

用于有機(jī)酸的測(cè)定方法很多, 如比色法、分光法、酶法、氣相色譜法等。但這些方法一般需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)分離或衍生化, 操作繁瑣, 且同時(shí)分離檢測(cè)的有機(jī)酸種類(lèi)較少。也有采用高效液相色譜法分析有機(jī)酸的報(bào)道[5～9], 但紫外（UV）檢測(cè)器在210 nm對(duì)干擾物質(zhì)的選擇性差。離子色譜法自20世紀(jì)70年代中期問(wèn)世以來(lái), 因其分析速度快、靈敏度高、能實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)分離定量等優(yōu)點(diǎn), 已經(jīng)成為分析有機(jī)酸的有效方法[10～16]。常規(guī)無(wú)機(jī)陰離子存在的條件下對(duì)測(cè)試有一定干擾, 因此同時(shí)分析有機(jī)酸和無(wú)機(jī)陰離子具有一定的挑戰(zhàn)性。作者采用戴安公司的 ICS3000型離子色譜系統(tǒng), 建立了優(yōu)化的梯度洗脫程序, 可以同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)嗜熱厭氧菌發(fā)酵液中的乙酸、乳酸等5種有機(jī)酸和等 5種無(wú)機(jī)陰離子, 結(jié)果準(zhǔn)確可靠。目前國(guó)內(nèi)相關(guān)的報(bào)道較少。

1 儀器與材料

ICS 3000多功能色譜裝置（美國(guó) Dionex公司）,包括雙泵（DP）模塊、抑制電導(dǎo)檢測(cè)器／色譜（DC）模塊、淋洗液自動(dòng)發(fā)生模塊（EG）、自動(dòng)進(jìn)樣器（AS）模塊。Milli-Q? Advantage A10超純水制備儀。

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品: 甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、丁酸均為色譜純（購(gòu)于上海晶純?cè)噭┯邢薰荆? 無(wú)機(jī)陰離子標(biāo)準(zhǔn)品:均為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 去離子水（電阻＞18.2 M?）, 其他試劑均為優(yōu)級(jí)純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

取 1 mL發(fā)酵液置于 2 mL塑料離心管中, 以6 000 r/min速度離心5 min, 固體雜質(zhì)沉淀于離心管底。取適量上清液, 用水稀釋 50倍, 稀釋液經(jīng)0.23 μm濾膜過(guò)濾除去微米級(jí)懸浮物。過(guò)IC-RP柱除去蛋白、色素等有機(jī)雜質(zhì)。

IC-RP柱（1.0 mL, Agela Technologies）使用前須先經(jīng)5 mL甲醇、10 mL水活化, 放置20 min后使用。當(dāng)樣品溶液通過(guò)該柱時(shí), 前面3 mL棄去, 后面溶液待檢測(cè)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

分別取上述測(cè)定項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)溶液, 配制不同濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按不同濃度分別進(jìn)樣, 以峰面積-濃度繪制各組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn), 表1列出了6個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度Tab. 1 Concentrations of standard solutions

2.3 色譜條件

IonPac AS11陰離子交換柱, 包括分析柱（250 mm×4 mm）和保護(hù)柱（50 mm×4 mm）。采用梯度淋洗,流速1 mL/min, 柱溫30 ℃, 進(jìn)樣體積 25 μL 。梯度淋洗程序見(jiàn)表2。

表2 梯度淋洗程序Tab. 2 Gradient profile for separation

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇

樣品的有效分離受到色譜柱和淋洗液的影響十分明顯。作者選用固定相為接枝型陰離子交換聚合物的IonPac AS11型陰離子交換柱, 基核是表面胺化的乙基乙烯基苯的聚合物, 親水性較強(qiáng)。接枝季胺基可以控制厚度, 導(dǎo)致快速的質(zhì)量傳遞而得到較高的色譜柱效。KOH中的 OH-是強(qiáng)親水性離子, 容易進(jìn)入樹(shù)脂親水區(qū), 以 KOH為淋洗液, 能同時(shí)分離與樹(shù)脂親和力不同的陰離子, 并且抑制產(chǎn)物是水, 本底電導(dǎo)比較低[17]。由于無(wú)機(jī)陰離子與固定相的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于小分子質(zhì)量的有機(jī)酸根離子, 故不易洗脫。為使10種離子在一定的時(shí)間內(nèi)完全洗脫, 故采用梯度淋洗方法。由試驗(yàn)得知, 丙酸、甲酸、丁酸在淋洗液濃度5～10 mmol時(shí)可得到良好的分離且峰形尖銳。但乳酸、乙酸的出峰時(shí)間接近, 分離度不到 1, 氟離子對(duì)乳酸有干擾, 因此使用較小濃度淋洗液洗脫,可達(dá)到理想的分離效果。由于無(wú)機(jī)陰離子和固定相的結(jié)合力較強(qiáng), 因此用大濃度淋洗液洗脫。采用0.1～2 mL/min不同流速做分離, 對(duì)組分的分離效果影響不大。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn), 確定最佳條件為流速1 mL/min, 梯度洗脫程序:

3.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度

實(shí)驗(yàn)測(cè)得有機(jī)酸的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均大于 0.99, 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（甲酸5.97 mg/L、乙酸4.42 mg/L、乳酸4.40 mg/L、丙酸4.06 mg/L、丁酸4.33 mg/L、磷酸根12.50 mg/L、硫酸根5.00 mg/L、硝酸根5.00 mg/L、氯離子5.00 mg/L、氟離子1.25 mg/L）連續(xù)進(jìn)樣6次, 測(cè)得有機(jī)酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%。結(jié)果見(jiàn)表3。

3.3 樣品分析

標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1。由圖1可見(jiàn), 在梯度洗脫程序下, 乳酸、乙酸和氟離子得到較好分離, 峰形尖銳。其他無(wú)機(jī)陰離子不干擾有機(jī)酸的測(cè)定。

表3 線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、回收率Tab. 3 Correlation coefficients, relative standard deviations, and revoveries

圖1 6#混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of a mixture of No. 6

有機(jī)酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.73%～1.01%, 加標(biāo)回收率為 88.1%～100.2%; 無(wú)機(jī)陰離子的平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.03%, 加標(biāo)回收率為92.6%～101.1%。

本方法用于嗜熱厭氧菌熱纖梭菌發(fā)酵液中乙酸、乳酸的測(cè)定。圖2為培養(yǎng)時(shí)間為18 h發(fā)酵液的色譜圖。發(fā)酵時(shí)間分別為3 h、6 h、18 h、24 h、40 h的測(cè)定結(jié)果如表4。作者也用試劑盒作了乙酸和乳酸的測(cè)定。雖然靈敏度也很高, 可達(dá)到5×106以下, 但該法不能同時(shí)分析多種有機(jī)酸, 且成本較高。

圖2 嗜熱厭氧菌培養(yǎng)時(shí)間為18 h樣品的色譜圖Fig. 2 The chromatogram of the sample with a fermentation time of 18 h

表4 原樣品分析結(jié)果Tab. 4 Results of original samples

4 結(jié)語(yǔ)

離子色譜法可同時(shí)測(cè)定嗜熱厭氧菌熱纖梭菌發(fā)酵液中的有機(jī)酸和無(wú)機(jī)陰離子, 本文所用方法相關(guān)性好, 排除了氟離子等其他無(wú)機(jī)陰離子的干擾, 為發(fā)酵工藝過(guò)程中技術(shù)監(jiān)控和質(zhì)量控制提供了有效的分析方法。

[1] Loret M O, Pedersen L, Francois J. Revised procedures for yeast metabolites extraction: application to a glucose pulse to carbon-limited yeast cultures, which reveals a transient activation of the purine salvage pathway[J]. Yeast, 2007, 24（1）: 47-60.

[2] Antoniewicz M R, Kraynie D F, Laffend L A,et al.Metabolic flux analysis in a nonstationary system:Fed-batch fermentation of a high yielding strain of E.coli producing 1,3-propanediol[J]. Metabeng, 2007,9（3）: 277-292.

[3] Teusink B, Wilersma A, Molenaar D, et al. Analysis of growth of lactobacillus plantarum WCFS1 on a complex medium using a genome-scale metabolic[J].Model Chem, 2006, 281: 40 041-40 048.

[4] Geng Xiu-mei, Zhang Su-fang, Wang Qian, et al. De-termination of organic acids in the presence of inorganic anions by ion chromatography with suppressed conductivity detection[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1192: 187-190.

[5] 錢(qián)兵, 章燕, 李莎, 等. 反相高效液相色譜法測(cè)定丙酸發(fā)酵液中的有機(jī)酸[J]. 分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào), 2007,35（11）: 1 651-1 653.

[6] Dan B, Sara H N, Sofia A E, et al. Analysis of low molecular mass organic acids in natural waters by ion exclusion chromatography tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A, 2007, 1176: 89-93.

[7] Destandau E, Vial J, Jardya A, et al. Development and validation of a reversed- phase liquid chromatography method for the quantitative determination of carboxylic acids in industrial reaction mixtures[J]. Journal of Chromatography A, 2005, 1088: 49-56.

[8] Chen S F, Mowery R A, Castleberr V A, et al.High-performance liquid chromatography method for simultaneous determination of aliphatic acid, aromatic acid and neutral degradation products in biomass pretreatment hydrolysates[J]. Journal of ChromatographyA, 2002, 1104: 54-61.

[9] Chinnici F, Spinabelli U, Riponi C, et al. Optimization of the determination of organic acids and sugars in fruit juices by ion-exclusion liquid chromatography[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2005, 18: 121-130.

[10] 丁明玉, 陳培榕, 羅國(guó)安. 離子色譜法同時(shí)分析董酒中的有機(jī)酸與無(wú)機(jī)陰離子[J]. 色譜, 1998, 16（1）:59-61.

[11] Agnieszka K, Velichka Kontozova-Deutsch, László B, et al. Single-run ion chromatographic separation of inorganic and low-molecular-mass organic anions under isocratic elution: Application to environmental samples[J]. Talanta, 2009, 79: 16-21.

[12] George T C, Katherine D H. Novel ion chromatography technique for the rapid identification and quantification of saturated and unsaturated low molecular weight organic acids formed during the Fenton oxidation of organic pollutants[J]. Journal of Chromatography A,2007, 1139: 95-103.

[13] Masson P. Influence of organic solvents in the mobile phase on the determination of carboxylic acids and inorganic anions in grape juice by ion chromatography[J].Journal of Chromatography A, 2000, 881: 387-394.

[14] Qiu Jin-shu, Jin Xiao-hong. Development and optimization of organic acid analysis in tobacco with ion chromatography and suppressed conductivity detection[J]. Journal of Chromatography A, 2002, 950:81-88.

[15] 屈峰, 劉克納, 牟世芬. 離子色譜法同時(shí)測(cè)定檸檬酸發(fā)酵液中無(wú)機(jī)陰離子和有機(jī)酸[J]. 環(huán)境化學(xué), 1995,14（5）: 466-470.

[16] 胡維勝, 汪東風(fēng), 劉源源, 等. 離子色譜法分析麥汁和啤酒體系中 9種有機(jī)酸含量的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35（4）: 947-948.

[17] 林華影, 林風(fēng)華, 盛麗娜, 等. 淋洗液自動(dòng)發(fā)生-離子色譜法同時(shí)測(cè)定食品中的 21種有機(jī)酸[J]. 色譜,2007, 25（1）: 107-111.

Received: Dec., 2, 2009

Key words:ion-chromatography; gradient elution; organic acid; fermentation broth

Abstract:Simultaneous separation of ten anions, including formate, acetate, lactate, phosphate, and sulfate, had been investigated using ion chromatography. The samples were prepared through filtration and clean-up column before analysis. Analysis was performed on an IonPac AS11 column coupled to a suppressed conductivity detector,with an injection volume of 25 μLand a flow rate of 1mL/min, The relative standard derivations of organic acids were 0.73%～1.01%. Analyte recoveries observed for triplicate analysis ranged from 88.1% to 101.2%. This method had been applied to determine low-molecular- weight organic acids and inorganic anions in Aerobic Microbes fermentation broth with satisfactory results.

（本文編輯:梁德海）

Simultaneous determination of organic and inorganic anions in Aerobic Microbes fermentation broth by ion chromatography

FA Yun, ZHANG Cong, YANG Hai-yan, BAO Yan, QIN Yong
（Key Laboratory of Bio-fuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Science, Qingdao 266101, China）

O658

A

1000-3096（2010）11-0023-04

2009-12-02;

2010-03-05

法蕓（1975-）, 女, 山東膠南人, 碩士, 高級(jí)工程師, 研究方向?yàn)榛瘜W(xué)分析, 電話(huà): 0532-80662692, E-mail: fayun@qibebt.ac.cn