羅 展, 張繼泉, 李富花, 柳承璋, 相建海

（1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院 研究生院, 北京 100049）

凡納濱對(duì)蝦C-型凝集素LvLec2對(duì)不同刺激的免疫應(yīng)答

羅 展1,2, 張繼泉1, 李富花1, 柳承璋1,2, 相建海1

（1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院 研究生院, 北京 100049）

克隆獲得了與中國(guó)明對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）C-type lectin 3同源的C-型凝集素LvLec2基因序列, 并通過 Real-time PCR研究了其在脂多糖（lipopolysaccharide, 簡(jiǎn)稱 LPS）、滅活溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）和白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus, 簡(jiǎn)稱WSSV）刺激后的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化。結(jié)果表明, LvLec2編碼157個(gè)氨基酸, 含有1個(gè)糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域（carbohydrate recognition domain,簡(jiǎn)稱CRD）, 其CRD結(jié)構(gòu)域中具有決定糖結(jié)合特異性的基序“EPS”（Glu118-Pro119-Ser120）序列。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明LvLec2與已發(fā)表的凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）C-型凝集素親緣較遠(yuǎn)。LPS、滅活溶壁微球菌和WSSV刺激后, LvLec2基因在肝胰臟中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)有明顯的變化但表達(dá)模式不同。LvLec2可能作為模式識(shí)別受體參與了對(duì)蝦對(duì)病原的識(shí)別或防御。

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）; C-型凝集素; 基因克隆; 不同刺激; 免疫應(yīng)答

同其他無脊椎動(dòng)物一樣, 甲殼動(dòng)物以先天性免疫的方式來識(shí)別入侵的“異己”物, 抵御外界病原體的侵襲。甲殼動(dòng)物對(duì)病原的識(shí)別是通過其模式識(shí)別受體或模式識(shí)別蛋白辨別各類病原體所共有的、固定的病原相關(guān)分子模式來完成的[1]。甲殼動(dòng)物模式識(shí)別受體主要包括肽聚糖識(shí)別蛋白、革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白、含硫酯鍵蛋白、清道夫受體、硫依賴型凝集素、血素、Toll樣受體和C-型凝集素等[2], 能夠識(shí)別微生物細(xì)胞壁的多糖成分, 例如革蘭氏陰性菌的細(xì)菌 LPS、革蘭氏陽(yáng)性菌的肽聚糖、真菌的 β-1,3-葡聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖等[3,4]。當(dāng)模式識(shí)別受體識(shí)別這些病原相關(guān)分子模式后, 會(huì)激活存在于甲殼動(dòng)物體液中的蛋白酶或細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)途徑從而引起細(xì)胞或體液免疫反應(yīng)[5]。

C-型凝集素幾乎存在于所有動(dòng)植物體內(nèi), 其凝集活性具有鈣離子依賴性。C-型凝集素的主要特征是在蛋白質(zhì)分子的C末端含有糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域CRD。作為一種模式識(shí)別受體, C-型凝集素參與“非己”識(shí)別和對(duì)入侵病原的清除過程[6,7]。據(jù)報(bào)道, 無脊椎動(dòng)物 C-型凝集素可參與多種免疫反應(yīng): 激活前酚氧化酶原、抗菌、吞噬、包囊、黑化作用以及結(jié)節(jié)的形成等, 在先天性免疫防御中具有重要作用[8～12]。近幾年, 對(duì)蝦 C-型凝集素的研究也逐漸開展起來, 目前已在中國(guó)明對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）、凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）、日本囊對(duì)蝦（Marsupen-aeus japonicus）、墨吉明對(duì)蝦（Fenneropenaeus merguiensis）等多種對(duì)蝦中發(fā)現(xiàn)C-型凝集素的存在[13～18]。

盡管在凡納濱對(duì)蝦中已報(bào)道了 LvLT[14]、LvCTL1[16]、LvLec[17]、LVL[19]等 C-型凝集素, 但本研究所克隆獲得的凡納濱對(duì)蝦 C-型凝集素基因LvLec2與已報(bào)道的凡納濱對(duì)蝦C-型凝集素相似性較低, 進(jìn)化親緣較遠(yuǎn)。LPS是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分, 作者將 LPS、滅活溶壁微球菌和 WSSV作為革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和病毒的代表, 對(duì)凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行免疫刺激。通過研究LvLec2基因在LPS、滅活溶壁微球菌和 WSSV刺激后的表達(dá)特征, 期望能發(fā)現(xiàn) C-型凝集素在對(duì)蝦防御病原感染中的作用,為對(duì)蝦免疫防御機(jī)制的研究做出有益補(bǔ)充, 并為對(duì)蝦疾病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦

凡納濱對(duì)蝦（體長(zhǎng)12.5 cm ± 0.5 cm, 體質(zhì)量25.5 g ± 0.5 g） 購(gòu)于青島膠州對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng), 實(shí)驗(yàn)前在水族箱中充氣暫養(yǎng)7 d, 使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)養(yǎng)殖環(huán)境。取健康對(duì)蝦血細(xì)胞, 并分離不同組織, 提取總 RNA用于cDNA合成。

1.2 免疫刺激實(shí)驗(yàn)

采用腹節(jié)注射法分別進(jìn)行 LPS、滅活溶壁微球菌和 WSSV的免疫刺激實(shí)驗(yàn), 并設(shè) PBS（phosphate buffer saline, 簡(jiǎn)稱PBS）對(duì)照組, 每組各注射30尾對(duì)蝦。LPS組, 每尾對(duì)蝦注射10 μL溶于無菌PBS的LPS溶液（5 mg/mL）; 滅活溶壁微球菌組, 每尾對(duì)蝦注射10 μL經(jīng)高壓滅菌的溶于無菌PBS的質(zhì)量濃度為0.2 g/L的溶壁微球菌溶液; WSSV 感染組, 每尾對(duì)蝦注射 10 μL WSSV組織提取液[20]; 感染實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組, 每尾對(duì)蝦注射10 μL無菌PBS溶液。免疫刺激后第0、6、12、24小時(shí)分別取蝦5尾, 解剖取其肝胰臟組織, 凍存于液氮中, 用于總RNA的提取。注射感染后的第3天, 從WSSV 感染組和對(duì)照組分別隨機(jī)取 5尾蝦, 取部分鰓組織提取 DNA, 用WSSV特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增, 結(jié)果在 WSSV注射組均擴(kuò)增出特異性條帶, 而在對(duì)照組中未檢測(cè)到, 證明感染實(shí)驗(yàn)是有效的。

1.3 cDNA片段的克隆

將NCBI中公布的161075條凡納濱對(duì)蝦EST序列進(jìn)行拼接、注釋和聚類分析（數(shù)據(jù)未發(fā)表）, 重點(diǎn)對(duì)其中注釋為lectin的序列進(jìn)行了分析, 發(fā)現(xiàn)有 39個(gè)contigs或 singletons被注釋為 C-型凝集素片段。選取其中與中國(guó)明對(duì)蝦C-type lectin 3同源的contig（命名為L(zhǎng)vLec2）進(jìn)行深入研究。利用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物 LvLec2-F1和 LvLec2-R1（表 1）, 以頭胸部cDNA為模板, PCR擴(kuò)增凡納濱對(duì)蝦LvLec2基因片段。擴(kuò)增LvLec2基因片段所用PCR反應(yīng)程序: 94oC變性4 min, 1個(gè)循環(huán); 94oC變性50 s, 55℃退火50 s,72oC延伸1 min, 35個(gè)循環(huán); 72oC延伸10 min, 1個(gè)循環(huán); 4oC保溫, PCR體系見表2。

1.4 生物信息學(xué)分析

將所測(cè)得序列利用 NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）上的 BLAST工具進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)基因序列的相似性及同源性查找和比對(duì), cDNA序列的開放閱讀框（open reading frame, 簡(jiǎn)稱ORF）分析等用Bioedit軟件進(jìn)行。選取部分在Genbank 中與LvLec2相似的其他物種的 C-型凝集素的 CRD 序列, 采用ClustalW 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析。將根據(jù) cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列, 利用 http://www.expasy.ch網(wǎng)站提供的蛋白質(zhì)組和序列分析工具進(jìn)行分析: 用ProtParam軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)基本物理化學(xué)參數(shù)分析,SingalP程序分析信號(hào)肽, Smart軟件預(yù)測(cè)功能域。利用MEGA 4.0軟件, 采用鄰接法在多序列比對(duì)的基礎(chǔ)上構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 實(shí)驗(yàn)中用到的引物及序列Tab. 1 Oligonucleotide primers used in this study

表2 PCR反應(yīng)體系Tab. 2 Components and reagents for polymerase chain reaction

1.5 基因的組織分布

提取健康的凡納濱對(duì)蝦不同組織（肝胰臟、血細(xì)胞、胃、腸、表皮、心臟、鰓和肌肉）的RNA, 合成cDNA進(jìn)行RT-PCR, 取不同組織cDNA各1 μL為模板, β-actin基因作為內(nèi)參（表 1）, 以 28個(gè)循環(huán)擴(kuò)增LvLec2的基因片段, 以27個(gè)循環(huán)擴(kuò)增β-actin的基因片段來檢測(cè)對(duì)蝦不同組織中LvLec2 mRNA的表達(dá)情況。反應(yīng)結(jié)束后, 每管取10 μL PCR 產(chǎn)物用2% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳, 電泳后用Quantity one 4.4 軟件分析電泳圖片。

1.6 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)檢測(cè)

利用六聚體隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄制備注射 LPS、滅活溶壁微球菌、WSSV和PBS后第0、6、12、24小時(shí)的肝胰臟組織cDNA, 作為Real-time PCR反應(yīng)的模板, LvLec2-F2和 LvLec2-R2（表 1）為 LvLec2基因Real-time PCR反應(yīng)的引物, 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為173 bp。根據(jù) Wang[21]報(bào)道的基因芯片數(shù)據(jù)信息, β-actin 基因在 WSSV刺激下的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化, 而磷酸丙糖異構(gòu)酶基因TPI（triosephosphate isomerase, 簡(jiǎn)稱TPI）的表達(dá)水平穩(wěn)定, 因而適合作為 WSSV刺激下基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因。LvTPI-F和 LvTPI-R（表 1）為TPI基因的特異引物, 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為107 bp。LPS刺激組和 PBS對(duì)照組以 β-actin基因作為內(nèi)參,β-actin-F和 β-actin-R為引物, 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 240 bp。Real-time PCR 反應(yīng)在 Eppendorf公司Mastercycler ep realplex 4S PCR儀上進(jìn)行, 采用Blend Taq-Plus- PCR反應(yīng)體系（表 3）, 所用染料為SYBR Green。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的cDNA樣品做兩組PCR,一組為內(nèi)參基因, 另一組為目的基因 LvLec2, 每組反應(yīng)進(jìn)行3次重復(fù)。LvLec2 基因的反應(yīng)條件為: 94oC變性2 min, 1個(gè)循環(huán); 94oC 變性20 s, 57 oC 退火 20 s,72oC 延伸20 s, 40 個(gè)循環(huán)。β-actin基因和 TPI基因的Real-time PCR反應(yīng)程序同LvLec2基因, 退火溫度分別為58℃和60oC。

表3 Real-time PCR反應(yīng)體系Tab. 3 Components and reagents for real-time polymerase chain reaction

數(shù)據(jù)處理采用 2-??Ct方法[22], 數(shù)據(jù)間的顯著性分析使用SPSS 11.5 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 cDNA片段的克隆

LvLec2基因包含1個(gè)474 bp的開放閱讀框ORF編碼157個(gè)氨基酸。ORF核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列信息見圖1。其推測(cè)的蛋白質(zhì)分子量為17.96 ku, 理論等電點(diǎn)為4.35。通過SMART軟件推測(cè), 該分子在N末端有1個(gè)17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽, C末端有1個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域。BLAST同源性檢索發(fā)現(xiàn), LvLec2與無脊椎動(dòng)物 C-型凝集素超家族成員具有較高的相似性。與LvLec2一致性最高的為中國(guó)明對(duì)蝦FcLec3（ACJ06431.1）, 高達(dá) 76%。與刀額新對(duì)蝦（Metapenaeus ensis）MeLT（ABV58637.1）的一致性為47%, 同中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）EsLT（ADB10837.1）具有37%的一致性, 與凡納濱對(duì)蝦 C-型凝集素 LvLT（ABI97374.1）一致性為27%。

2.2 與其他甲殼動(dòng)物 C-型凝集素 CRD多序列比對(duì)分析

通過 LvLec2與其他甲殼動(dòng)物 C-型凝集素 CRD進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), LvLec2含有該超家族保守的氨基酸位點(diǎn)。其CRD含有的參與二硫鍵形成的4個(gè)保守的半胱氨酸, 分別位于: Cys21, Cys32, Cys49和Cys149, 是典型的短型的C-型凝集素。LvLec2的CRD中決定糖結(jié)合特異性的基序?yàn)椤癊PS”（Glu118-Pro119-Ser120）序列（圖 2）。

圖1 凡納濱對(duì)蝦LvLec2基因的ORF核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 1 The ORF and deduced amino acid sequence of LvLec2 from L. vannamei

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用 MEGA4.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 研究了凡納濱對(duì)蝦C-型凝集素LvLec2的分類歸屬以及與其他甲殼動(dòng)物C-型凝集素之間的進(jìn)化關(guān)系。由圖3可見, LvLec2與來自對(duì)蝦的C-型凝集素聚在同一類群, 與中國(guó)明對(duì)蝦 FcLec3聚在同一分支上, 在進(jìn)化上親緣關(guān)系最近, 同已報(bào)道的凡納濱對(duì)蝦 C-型凝集素LvLT、LvLec、LvCTL1未聚在同一個(gè)分支。

圖2 LvLec2的CRD與其他C-型凝集素的CRD進(jìn)行多序列比對(duì)Fig. 2 Alignment of the CRD sequence of the LvLec2 from L. vannamei with C-type lectin CRD sequences from other crustaceans

2.4 組織分布

采用半定量 RT-PCR的方法分析了 LvLec2 mRNA在健康凡納濱對(duì)蝦不同組織中的表達(dá)特征。LvLec2 基因在肝胰臟中表達(dá)量最高, 其次為胃, 在鰓、腸、心臟和肌肉組織中都有微弱表達(dá)（圖4）。

2.5 免疫刺激后LvLec2基因在凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

利用Real-time PCR方法分析了LPS、滅活溶壁微球菌和WSSV免疫刺激凡納濱對(duì)蝦后, LvLec2基因在對(duì)蝦肝胰臟組織中的表達(dá)變化（圖5）。

2.5.1 LPS注射組

注射LPS實(shí)驗(yàn)組中LvLec2 mRNA 的表達(dá)變化圖譜如圖 5-A 所示。結(jié)果顯示, LvLec2基因的表達(dá)在注射 PBS的對(duì)照組中基本沒有變化, 在注射 LPS第6小時(shí)時(shí)略有上調(diào), 12 h恢復(fù)到接近對(duì)照的水平,而24 h時(shí) LvLec2 mRNA 的表達(dá)量又顯著上調(diào), 且與對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01）。

2.5.2 滅活溶壁微球菌注射組

如圖5-B, 注射滅活溶壁微球菌組, LvLec2基因的表達(dá)量在注射后6、12 h與對(duì)照組相近, 24 h時(shí)略有上升, 與對(duì)照組出現(xiàn)了顯著性差異（P＜0.01）。

圖3 不同甲殼動(dòng)物C-型凝集素的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of C-type lectins from crustacean

圖4 RT-PCR檢測(cè)凡納濱對(duì)蝦不同組織中LvLec2基因的表達(dá)情況Fig. 4 Detection of LvLec2 transcripts by RT-PCR

2.5.3 WSSV感染組

注射WSSV實(shí)驗(yàn)組中LvLec2 mRNA 的表達(dá)變化圖譜如圖5-C所示。LvLec2基因的表達(dá)在WSSV感染初期第 6小時(shí)便呈現(xiàn)顯著性上調(diào), 后逐漸降低,12 h時(shí)表達(dá)量接近對(duì)照組水平, 24 h時(shí)與對(duì)照組相比顯著下調(diào)（P＜0.05）。

3 討論

C-型凝集素是一類具有凝集活性和鈣離子依賴性的蛋白超家族, 其主要特征是在蛋白質(zhì)分子的 C末端含有CRD。目前, 已報(bào)道的對(duì)蝦C-型凝集素都有一個(gè)或兩個(gè)CRD。如斑節(jié)對(duì)蝦PmAV[23]、中國(guó)明對(duì)蝦 FcLec1[24]都含有一個(gè) CRD, 而中國(guó)明對(duì)蝦Fclectin[13]、凡納濱對(duì)蝦LvLT[14]和斑節(jié)對(duì)蝦PmLT[15]序列中都有2個(gè)串聯(lián)的CRD。本研究中獲得C-型凝集素LvLec2, C末端只有1個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域。

圖5 LPS注射組（A）、滅活溶壁微球菌注射組（B）和WSSV感染組（C）的不同時(shí)間凡納濱對(duì)蝦肝胰臟組織 LvLec2 mRNA的表達(dá)變化Fig.5 Relative LvLec2 mRNA expression levels in hepatopancreas at different time intervals post LPS （A）,M.lysodeikticus （B） and WSSV injection （C）

存在于血淋巴中的可溶性凝集素, 可以同病原分子等表面的糖基決定簇結(jié)合, 從而導(dǎo)致病原或異物的凝集; 存在于細(xì)胞膜表面的凝集素, 血細(xì)胞可以通過凝集素分子與異物分子表面結(jié)合, 以便對(duì)異物分子進(jìn)行吞噬或包圍[2]。根據(jù)結(jié)構(gòu)和糖結(jié)合活性的不同, C-型凝集素大致可分為半乳糖結(jié)合型凝集素和甘露糖結(jié)合型凝集素。半乳糖結(jié)合型凝集素的糖結(jié)合位點(diǎn)有保守的“QPD”（Gln-Pro-Asp） 基序, 能與半乳糖和半乳糖的衍生物結(jié)合; 而甘露糖結(jié)合型凝集素的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域?yàn)椤癊PN”（Glu-Pro-Asn）, 能夠結(jié)合甘露糖及甘露糖的衍生物。在許多無脊椎動(dòng)物中, “EPN”也可能被“EPD”（Glu-Pro-Asp）、“EPS”（Glu-Pro-Ser）所替代, 如中國(guó)明對(duì)蝦 FcLec3和來自櫛孔扇貝（Chlamys farreri）的 CfLec-2[25]。LvLec2的CRD結(jié)構(gòu)域中具有“EPS”（Glu118-Pro119-Ser120）序列,推測(cè)其可與甘露糖及甘露糖的衍生物相結(jié)合。

凡納濱對(duì)蝦中克隆獲得的 C-型凝集素基因LvLT[14]在病毒注射后2 h表達(dá)下調(diào), 4 h后表達(dá)量升高。 Zhao等[16]克隆的 LvCTL1具有“EPN”位點(diǎn), 可與 WSSV 囊膜蛋白 VP95、VP28、VP26、VP24、VP19和VP14相互結(jié)合。重組rLvCTL1可阻斷WSSV的感染, 延長(zhǎng)對(duì)蝦的存活時(shí)間。另外, Zhang等[17]克隆的LvLec具有“EPN”位點(diǎn), 在Ca2+存在的情況下可凝集大腸桿菌JM109, 凝集活性可被甘露糖和EDTA抑制。通過SMART軟件預(yù)測(cè)LvLec2的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域含有C-型凝集素超家族參與二硫鍵形成的4個(gè)保守的半胱氨酸, 是典型的短型的 C-型凝集素。根據(jù)BLAST序列比對(duì)以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果, 雖然LvLec2與中國(guó)明對(duì)蝦 C-型凝集素 FcLec3同源性較高, 但其與已知的凡納濱對(duì)蝦 C-型凝集素 LvLT、LvCTL1和 LvLec相似性很低, 在進(jìn)化上距離較遠(yuǎn),是凡納濱對(duì)蝦C-型凝集素家族的新成員。

肝胰臟是對(duì)蝦重要的消化和免疫器官, 它參與消化、吸收、儲(chǔ)存和代謝等生理活動(dòng), 對(duì)環(huán)境的變化和水媒性的污染物非常敏感, 并且在啟動(dòng)對(duì)蝦免疫反應(yīng)中起重要作用。目前發(fā)現(xiàn)的對(duì)蝦 C-型凝集素大部分都在肝胰臟中表達(dá)。組織分布結(jié)果顯示,LvLec2組織分布特點(diǎn)同與其親緣最近的中國(guó)明對(duì)蝦FcLec3[26]相一致, 主要在對(duì)蝦肝胰臟中表達(dá)。FcLec3半定量 PCR和免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示, 其主要分布于與消化酶的合成與分泌相關(guān)的肝胰臟 F細(xì)胞中。

當(dāng)受到免疫刺激時(shí), 肝胰臟中LvLec2表達(dá)水平都呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)趨勢(shì)。與LvLec2同源性較高的中國(guó)明對(duì)蝦 FcLec3[26], 注射鰻弧菌（Vibrio anguillarum）后第 2小時(shí), 其表達(dá)量開始上升, 并于第12小時(shí)達(dá)到最高值; 在WSSV感染后2～6 h表達(dá)量增高, 并逐漸恢復(fù)到正常水平, 第 24小時(shí)再次出現(xiàn)表達(dá)上調(diào), 推測(cè)可能存在二次免疫作用。相對(duì)于LPS和滅活溶壁微球菌,LvLec2對(duì)WSSV的感染更為敏感, 在WSSV注射后第6小時(shí)出現(xiàn)了明顯的上調(diào), 這與Fclec3在感染W(wǎng)SSV后2～6 h的表達(dá)趨勢(shì)一致, 但6～24 hLvLec2表達(dá)量逐漸降低至正常水平, 未出現(xiàn)中國(guó)明對(duì)蝦 FcLec3的二次免疫現(xiàn)象, 推測(cè)雖然LvLec2與FcLec3同源性較高, 但不同的C-型凝集素在抗病原感染時(shí)發(fā)揮不同的作用。另外, 體外重組的FcLec3已被證實(shí)可與重組的WSSV囊膜蛋白VP28相互結(jié)合, 這提示LvLec2也可能參與了對(duì)WSSV的識(shí)別。為了進(jìn)一步證實(shí)LvLec2的模式識(shí)別功能, 我們將通過體外重組表達(dá)LvLec2, 檢驗(yàn)其凝菌活性和糖結(jié)合活性, 并通過蛋白質(zhì)互作技術(shù)驗(yàn)證其與WSSV囊膜蛋白的相互作用。

迄今, 已從中國(guó)明對(duì)蝦中獲得 7個(gè) C-型凝集素基因, 凡納濱對(duì)蝦以及斑節(jié)對(duì)蝦等對(duì)蝦體內(nèi)都已克隆或分離到多種 C-型凝集素。本實(shí)驗(yàn)室在分析凡納濱對(duì)蝦ESTs拼接數(shù)據(jù)庫(kù)的contigs時(shí)也發(fā)現(xiàn)了39個(gè)C-型凝集素的基因片段。在與甲殼動(dòng)物進(jìn)化相近的模式動(dòng)物果蠅基因組中發(fā)現(xiàn)了 32種 C-型凝集素[6],結(jié)合目前對(duì)蝦 C-型凝集素的相關(guān)報(bào)道, 作者推測(cè)對(duì)蝦中可能還有多種 C-型凝集素的存在, 也將陸續(xù)對(duì)凡納濱對(duì)蝦 ESTs拼接數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的 C-型凝集素進(jìn)行克隆和功能驗(yàn)證。

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Received: Jul, 29, 2010

Key words:Litopenaeus vannamei; C-type lectin; gene cloning; different challenge; immune response

Abstract:A novel C-type lectin gene LvLec2 was cloned from Litopenaeus vannamei. LvLec2 shared high identity with C-type lectin 3 from Fenneropenaeus chinensis. The deduced amino acid sequence of LvLec2 contained 157 amino acid residues and a carbohydrate recognition domain （CRD） at the C-terminal. There was a potential carbohydrate-bingding motif “EPS” （Glu118-Pro119-Ser120） in the CRD, and it might bind mannose-type sugars. BLAST search and phylogenetic analysis showed LvLec2 shared far evolutionary relationship with other C-type lectins from L. vannamei. In healthy shrimp L. vannamei, LvLec2 was mainly expressed in hepatopancreas. Real-time PCR analysis indicated that LvLec2 transcripts level showed significant change in hepatopancreas after the shrimp were artificially challenged with LPS, inactived Micrococcus lysodeikticus, and white spot syndrome virus （WSSV）. The results suggested that LvLec2 might be involved in the immune response against WSSV infection, and might contribute to non-self recognition by functioning as a pattern recognition receptor in the innate immune system of shrimp L.vannamei.

（本文編輯:譚雪靜）

Cloning of a novel C-type lectin LvLec2 from the shrimp Litopenaeus vannamei and its immune response to different challenges

LUO Zhan1,2, ZHANG Ji-quan1, LI Fu-hua1, LIU Cheng-zhang1,2, XIANG Jian-hai1
（1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266071, China; 2. Graduate University, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China）

Q786

A

1000-3096（2010）11-0103-08

2010-07-29;

2010-08-15

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目（973計(jì)劃）（2006CB101804）; 農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2010GB24910700）

羅展（1981-）, 女, 博士研究生, 主要從事甲殼動(dòng)物免疫相關(guān)基因及功能研究, 電話: 0532-82898571, E-mail: bluelz_2001@163.com; 相建海, 通信作者, 電話: 0532-82898568, E-mail: jhxiang@ms.qdio.ac.cn