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        犬瘟熱病毒在不同組織細胞上增殖特性的研究

        2010-09-21 02:44:32王金良祖立闖沈志強
        動物醫(yī)學進展 2010年2期
        關鍵詞:犬瘟熱濱州細胞系

        魏 鳳,管 宇,王金良,祖立闖,沈志強*

        (1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600;2.山東省畜禽用蜂膠疫苗工程技術研究中心,山東濱州 256600)

        犬瘟熱(Canine distemper,CD)是由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的多種動物發(fā)生的一種急性、高度接觸性傳染病[1]。據(jù)資料報道,CDV能適應多種細胞培養(yǎng)物,如 Vero細胞、MDCK細胞、犬腦細胞、T淋巴細胞、雞胚成纖維細胞、犬肺巨噬細胞等。且在不同細胞上的生物學特性也不盡一致[2]。本試驗旨在通過了解CDV在不同細胞上的生長特性,以期尋找培養(yǎng)該病毒毒價高、病變明顯的細胞,為疫苗生產(chǎn)及大量制備抗原物質提供試驗數(shù)據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        CDV種毒、Vero細胞和MDCK細胞均由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預防獸醫(yī)學與動物生物技術重點開放實驗室保存,雞胚成纖維細胞(CEF)自備。細胞培養(yǎng)生長液為DMEM,新生牛血清(FBS)為北京民海生物科技有限公司產(chǎn)品。

        1.2 方法

        1.2.1 細胞的傳代 Vero細胞的培養(yǎng)液為DMEM+60 mL/L FBS,CEF和MDCK細胞的培養(yǎng)液為DMEM+70 mL/L FBS;Vero細胞和MDCK細胞的培養(yǎng)方法為連續(xù)單層傳代培養(yǎng),CEF細胞為原代培養(yǎng)。

        1.2.2 病毒增殖 取適量的CDV病毒液分別接種于長滿單層的Vero細胞、MDCK細胞及CEF細胞后,置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),逐日觀察病變情況,當出現(xiàn)70%~80%細胞病變(CPE)時收獲,凍存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.3 RT-PCR鑒定

        1.2.3.1 引物 根據(jù)GenBank上發(fā)表的CDV F蛋白基因序列,DNAMAN比對CDV F蛋白基因序列,利用Primer 5.0在保守區(qū)設計1對引物,擴增目的片段大小為337 bp。

        P1:5′-TGGTACTGGCAGGTGCAGCTTTAGG-3′;P2:5′-TCGGCTGAAATAGGATCACGTAAAC-3′,引物由上海生物技術有限公司合成。

        1.2.3.2 RNA的提取 將CDV在MDCK細胞、CEF和Vero細胞連續(xù)傳5代的培養(yǎng)物進行RTPCR擴增。其方法按參考文獻[3]操作。

        1.2.3.3 RT-PCR擴增 以提取的病毒基因組RNA為模板,首先反轉錄為cDNA。反轉錄體系為20 μ L:5 ×RT buffer 4 μ L,dNTP(2.5 mmoL/L)2 μ L,上 游 引 物 1 μ L,總 RNA 11.5 μ L,HPR 0.5 μ L,M-Mulv RT 1 μ L 。42 ℃作用 1 h,70 ℃滅活5 min。以cDNA為模板進行PCR反應,反應體系 為 25 μ L:10 × PCR buffer 2.5 μ L,dNTPs(2.5 mmoL/L)2 μ L,上 游 引 物 1 μ L,下 游 引 物1 μ L,cDNA 5 μ L,rTaq 0.5 μ L,ddH2O 13 μ L 。反應條件:94℃45 s,55℃45 s,72℃45 s,35個循環(huán)后,72℃延伸10 min。取5 μ L PCR產(chǎn)物,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

        1.2.4 毒力測定 用96孔細胞培養(yǎng)板進行毒價測定。將在不同細胞上接種CDV后收獲的病毒液分別做10-1~10-10倍梯度稀釋,每個稀釋度接種8個孔,每孔加入不同稀釋度的病毒液100 μ L。置體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱 37℃培養(yǎng) 7 d,逐日記錄CPE情況。根據(jù)Reed-Munch法計算TCID50[4]。

        2 結果

        2.1 CDV在不同細胞上的培養(yǎng)特性

        將CDV分別接種 CEF、MDCK、Vero細胞,結果在上述細胞上均能增殖,并產(chǎn)生明顯的CPE,但在不同細胞上的表現(xiàn)有所不同。在Vero細胞上CPE出現(xiàn)最快,接毒后第2天能看見輕微的CPE,主要表現(xiàn)為細胞內(nèi)顆粒增多,聚集成小集落,細胞圓縮,折光率變低,第4天時CPE最明顯,主要表現(xiàn)為細胞顆粒增多,病變細胞融合成較大的圓形合胞體細胞,并形成拉網(wǎng)狀,有細胞脫落(圖1A,B)此時將病毒液收獲凍存?zhèn)溆?在MDCK細胞上的病變特征主要表現(xiàn)為:接毒后第4天細胞出現(xiàn)細胞輕微聚集、拉網(wǎng),第5天時病變細胞聚集、變圓、膨大、拉網(wǎng)脫落(圖2A,B);CDV在CEF上的病變特征主要表現(xiàn)為,接毒后第4天細胞輕微聚集,出現(xiàn)星芒狀,形成小的多核聚細胞,并在細胞中出現(xiàn)空泡,第5天病變細胞聚集,形成明顯的多核聚細胞,并出現(xiàn)破碎、拉網(wǎng)現(xiàn)象(圖3A,圖 3B為正常CEF細胞)。

        圖1 接種CDV 96 h的Vero細胞CPEFig.1 The cytopathogenic effect of Vero cells at 96th hours post infection with CDV

        圖2 接種CDV 120 h的MDCK細胞CPEFig.2 The cytopathogenic effect of MDCK cells at 120th hours post infection with CDV

        圖3 接種CDV 120 h的CEF細胞CPEFig .3 T he cy topathogenic effect of CEF cells at 120th post infection with CDV

        2.2 RT-PCR鑒定結果

        經(jīng)RT-PCR后,均能擴增出目的片段337 bp(圖4)。說明CDV在Vero、CEF和MDCK細胞上均能增殖。

        圖4 RT-PCR擴增結果Fig.4 The results of RT-PCR amplification

        2.3 CDV在不同細胞上的病毒毒力測定

        由此可看出,就病毒滴度這方面來說,Vero細胞更適合CDV的增殖(表1)。

        表1 CDV在不同細胞上的毒力測定結果Table 1 CDV TCID50in the different cells

        3 討論

        CDV能在許多細胞上生長,如原代細胞的有犬或貂的肺和腹腔巨噬細胞、腎細胞、胚胎細胞、外周血淋巴細胞、犢牛的腎細胞和雞胚成纖維細胞等。傳代細胞系有犬腎細胞系、貓腎細胞系、乳倉鼠胎腎細胞系、非洲綠猴腎細胞系等[5]。研究表明,Vero細胞是培養(yǎng)CDV的首選細胞[6-7]。試驗結果可以看出,CDV在3種細胞中均能增殖,并產(chǎn)生明顯病變。在Vero細胞上增殖,不僅病變時間早,病變明顯,而且毒價比在MDCK和CEF細胞上都高。實驗室條件下Vero細胞更適宜CDV的增殖,這與Loffer S等的研究結果基本一致[8-10]。因此,犬瘟熱疫苗的生產(chǎn)選用Vero細胞更為合適。以上結果只是初步的試驗結果,如果根據(jù)不同細胞的培養(yǎng)特性進行培養(yǎng)條件優(yōu)化,測定CDV的最高培養(yǎng)效價,究竟是何種細胞毒價更高,有待進一步試驗研究。

        CDV能在多種細胞上生長,Vero細胞為生產(chǎn)犬瘟熱疫苗或制備大量抗原的首選細胞。

        [1]宗春苗,王全凱,王卓聰,等.狐源犬瘟熱病毒的分離及 RTPCR鑒定[J].經(jīng)濟動物學報,2006,10(4):195-197.

        [2]楊篤寶,呂 品,胡傳偉,等.狐源犬瘟熱病毒泰安株(CDVFOX-TA)的分離與鑒定[J].西南農(nóng)業(yè)學報,2008,21(1):204-207.

        [3]王化磊,楊松濤,鄭學星,等.狂犬病病毒和犬瘟熱病毒疫苗株混合感染 Vero細胞的實驗研究[J].中國病原生物學雜志,2008,3(6):401-403.

        [4]殷 震,劉景華.動物病毒學[M].北京:科學技術出版社,1997:343-347.

        [5]鮮思美,徐在品,張登祥,等.貴州犬瘟熱病毒的分離鑒定[J].畜牧與獸醫(yī),2006,38(10):15-17.

        [6]Comp Pathol J.G rowth profiles of recent canine dietemper isolates on Vero cells expressing canine signaling lymphocyte activation molecule[J].2005,133(1):77-81.

        [7]陳培富,郭愛珍,陸承平,等.犬瘟熱病毒南京分離株的生物學特性鑒定[J].中國獸醫(yī)學報,2000,20(3):231-234.

        [8]Loffer S,Lottspeich F,Stettler M,et al.CDV transmembrane protein renders cells susceptible to canine distemper virus[J].Virol Jan,1997,17(1):42-49.

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        [10]Lan N T,Yamaguchi R,Uchida K,et al.Growth profiles of recent canine distemper isolates on vero cells expressing canine signalling lymphocyte activation molecule[J].J Comp Path,2005,133:77-81.

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