魏 鳳,管 宇,王金良,祖立闖,沈志強(qiáng)*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600;2.山東省畜禽用蜂膠疫苗工程技術(shù)研究中心,山東濱州 256600)

犬瘟熱(Canine distemper,CD)是由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的多種動物發(fā)生的一種急性、高度接觸性傳染病[1]。據(jù)資料報道,CDV能適應(yīng)多種細(xì)胞培養(yǎng)物,如 Vero細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、犬腦細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞、犬肺巨噬細(xì)胞等。且在不同細(xì)胞上的生物學(xué)特性也不盡一致[2]。本試驗(yàn)旨在通過了解CDV在不同細(xì)胞上的生長特性,以期尋找培養(yǎng)該病毒毒價高、病變明顯的細(xì)胞,為疫苗生產(chǎn)及大量制備抗原物質(zhì)提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

CDV種毒、Vero細(xì)胞和MDCK細(xì)胞均由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存,雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)自備。細(xì)胞培養(yǎng)生長液為DMEM,新生牛血清(FBS)為北京民海生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的傳代 Vero細(xì)胞的培養(yǎng)液為DMEM+60 mL/L FBS,CEF和MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)液為DMEM+70 mL/L FBS;Vero細(xì)胞和MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)方法為連續(xù)單層傳代培養(yǎng),CEF細(xì)胞為原代培養(yǎng)。

1.2.2 病毒增殖 取適量的CDV病毒液分別接種于長滿單層的Vero細(xì)胞、MDCK細(xì)胞及CEF細(xì)胞后,置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),逐日觀察病變情況,當(dāng)出現(xiàn)70%～80%細(xì)胞病變(CPE)時收獲,凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-PCR鑒定

1.2.3.1 引物 根據(jù)GenBank上發(fā)表的CDV F蛋白基因序列,DNAMAN比對CDV F蛋白基因序列,利用Primer 5.0在保守區(qū)設(shè)計1對引物,擴(kuò)增目的片段大小為337 bp。

P1:5′-TGGTACTGGCAGGTGCAGCTTTAGG-3′;P2:5′-TCGGCTGAAATAGGATCACGTAAAC-3′,引物由上海生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3.2 RNA的提取 將CDV在MDCK細(xì)胞、CEF和Vero細(xì)胞連續(xù)傳5代的培養(yǎng)物進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增。其方法按參考文獻(xiàn)[3]操作。

1.2.3.3 RT-PCR擴(kuò)增 以提取的病毒基因組RNA為模板,首先反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μ L:5 ×RT buffer 4 μ L,dNTP(2.5 mmoL/L)2 μ L,上 游 引 物 1 μ L,總 RNA 11.5 μ L,HPR 0.5 μ L,M-Mulv RT 1 μ L 。42 ℃作用 1 h,70 ℃滅活5 min。以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系 為 25 μ L:10 × PCR buffer 2.5 μ L,dNTPs(2.5 mmoL/L)2 μ L,上 游 引 物 1 μ L,下 游 引 物1 μ L,cDNA 5 μ L,rTaq 0.5 μ L,ddH2O 13 μ L 。反應(yīng)條件:94℃45 s,55℃45 s,72℃45 s,35個循環(huán)后,72℃延伸10 min。取5 μ L PCR產(chǎn)物,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 毒力測定 用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行毒價測定。將在不同細(xì)胞上接種CDV后收獲的病毒液分別做10-1～10-10倍梯度稀釋,每個稀釋度接種8個孔,每孔加入不同稀釋度的病毒液100 μ L。置體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱 37℃培養(yǎng) 7 d,逐日記錄CPE情況。根據(jù)Reed-Munch法計算TCID50[4]。

2 結(jié)果

2.1 CDV在不同細(xì)胞上的培養(yǎng)特性

將CDV分別接種 CEF、MDCK、Vero細(xì)胞,結(jié)果在上述細(xì)胞上均能增殖,并產(chǎn)生明顯的CPE,但在不同細(xì)胞上的表現(xiàn)有所不同。在Vero細(xì)胞上CPE出現(xiàn)最快,接毒后第2天能看見輕微的CPE,主要表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)顆粒增多,聚集成小集落,細(xì)胞圓縮,折光率變低,第4天時CPE最明顯,主要表現(xiàn)為細(xì)胞顆粒增多,病變細(xì)胞融合成較大的圓形合胞體細(xì)胞,并形成拉網(wǎng)狀,有細(xì)胞脫落(圖1A,B)此時將病毒液收獲凍存?zhèn)溆?在MDCK細(xì)胞上的病變特征主要表現(xiàn)為:接毒后第4天細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞輕微聚集、拉網(wǎng),第5天時病變細(xì)胞聚集、變圓、膨大、拉網(wǎng)脫落(圖2A,B);CDV在CEF上的病變特征主要表現(xiàn)為,接毒后第4天細(xì)胞輕微聚集,出現(xiàn)星芒狀,形成小的多核聚細(xì)胞,并在細(xì)胞中出現(xiàn)空泡,第5天病變細(xì)胞聚集,形成明顯的多核聚細(xì)胞,并出現(xiàn)破碎、拉網(wǎng)現(xiàn)象(圖3A,圖 3B為正常CEF細(xì)胞)。

圖1 接種CDV 96 h的Vero細(xì)胞CPEFig.1 The cytopathogenic effect of Vero cells at 96th hours post infection with CDV

圖2 接種CDV 120 h的MDCK細(xì)胞CPEFig.2 The cytopathogenic effect of MDCK cells at 120th hours post infection with CDV

圖3 接種CDV 120 h的CEF細(xì)胞CPEFig .3 T he cy topathogenic effect of CEF cells at 120th post infection with CDV

2.2 RT-PCR鑒定結(jié)果

經(jīng)RT-PCR后,均能擴(kuò)增出目的片段337 bp(圖4)。說明CDV在Vero、CEF和MDCK細(xì)胞上均能增殖。

圖4 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 The results of RT-PCR amplification

2.3 CDV在不同細(xì)胞上的病毒毒力測定

由此可看出,就病毒滴度這方面來說,Vero細(xì)胞更適合CDV的增殖(表1)。

表1 CDV在不同細(xì)胞上的毒力測定結(jié)果Table 1 CDV TCID50in the different cells

3 討論

CDV能在許多細(xì)胞上生長,如原代細(xì)胞的有犬或貂的肺和腹腔巨噬細(xì)胞、腎細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞、犢牛的腎細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞等。傳代細(xì)胞系有犬腎細(xì)胞系、貓腎細(xì)胞系、乳倉鼠胎腎細(xì)胞系、非洲綠猴腎細(xì)胞系等[5]。研究表明,Vero細(xì)胞是培養(yǎng)CDV的首選細(xì)胞[6-7]。試驗(yàn)結(jié)果可以看出,CDV在3種細(xì)胞中均能增殖,并產(chǎn)生明顯病變。在Vero細(xì)胞上增殖,不僅病變時間早,病變明顯,而且毒價比在MDCK和CEF細(xì)胞上都高。實(shí)驗(yàn)室條件下Vero細(xì)胞更適宜CDV的增殖,這與Loffer S等的研究結(jié)果基本一致[8-10]。因此,犬瘟熱疫苗的生產(chǎn)選用Vero細(xì)胞更為合適。以上結(jié)果只是初步的試驗(yàn)結(jié)果,如果根據(jù)不同細(xì)胞的培養(yǎng)特性進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化,測定CDV的最高培養(yǎng)效價,究竟是何種細(xì)胞毒價更高,有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

CDV能在多種細(xì)胞上生長,Vero細(xì)胞為生產(chǎn)犬瘟熱疫苗或制備大量抗原的首選細(xì)胞。

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