王彩霞,劉 建,林祥梅,吳紹強(qiáng)

(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)植物檢疫研究所,北京 100029)

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒科的非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。1921年Montgomery在非洲肯尼亞首先發(fā)現(xiàn)。由于對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害較大,而且尚無有效的疫苗用于防控,因此它被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為必報(bào)傳染病之一。

我國地域遼闊,北部與東歐國家接壤,而東歐國家最近發(fā)生的非洲豬瘟疫情必須引起我們的關(guān)注。從2007年11月以來的1年時(shí)間里,俄羅斯共計(jì)暴發(fā)非洲豬瘟 45起,感染發(fā)病2 586頭,死亡2 481頭,共計(jì)10 583萬頭豬被淘汰[2]。我國與俄羅斯接壤邊境線長(zhǎng)達(dá)4 300 km,而且很多地區(qū)還是陸地接壤,野豬等野生動(dòng)物跨境活動(dòng)頻繁,建立現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法,對(duì)于防止疫病跨境傳播極為必要。

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增 (loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是日本學(xué)者開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法,具有快速、敏感、特異、儀器設(shè)備要求低、結(jié)果判定簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。近年來,國內(nèi)外已應(yīng)用該法在細(xì)菌性疾病[3]、病毒性疾病[4]、寄生蟲病[5]等多種動(dòng)物疫病的檢測(cè)方面以及植物物種鑒別、轉(zhuǎn)基因與耐藥基因研究和胚胎性別鑒定等方面開展了大量的研究工作。

本研究以人工合成的ASFV P72基因?yàn)槟０?通過設(shè)計(jì)外引物和內(nèi)引物,建立了快速檢測(cè)ASFV的LAMP檢測(cè)方法,并對(duì)結(jié)果判定方法進(jìn)行了敏感性比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 陽性樣品 根據(jù)GenBank中收錄的AY578689核酸序列,由寶生物工程(大連)有限公司合成ASFV P72全長(zhǎng)基因并插入載體PMD18-T中,置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 Bst DNA Polymerase購自紐英倫(NEB)生物技術(shù)(北京)有限公司,Betaine Hydrochloride購自Biocity公司,SYBR Green nucleic acid gel stain購自Invitrogen公司,Eva GreenTM購自美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 以AY578689為靶序列,利用在線軟件Primer Explorer 4設(shè)計(jì)LAMP擴(kuò)增的內(nèi)引物和外引物,設(shè)計(jì)引物經(jīng)采用Oligo 4軟件進(jìn)一步篩選后,選擇最佳的 1套,送上海英駿(Invitrogen)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。引物序列為:ASFF31(5′-GTAGACGCAATATACGCTTTA );ASFB31(5′-GCCATTTAAGAGCAGACATT);ASFFIP1(5′-GACCAAGTGCTTATATCCAGTCATTTTTT GGATCC ATATAGTTCGGATGT);ASFBIP1(5′-GGAGGTATCGGTGGAGGGAATTTT GAATTCGCAAATCATGAATGT)。

1.2.2 非洲豬瘟病毒LAMP檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化 以P72陽性質(zhì)粒為模板,分別對(duì)反應(yīng)體系中MgSO4(2mmol/L ～ 32mmol/L)、Betaine(64 mmol/L～1280 mmol/L)、dNTP以及內(nèi)外引物等各個(gè)成分采用不同濃度配制反應(yīng)體系,將反應(yīng)管置于實(shí)時(shí)熒光PCR儀(IQ5,Bio-Rad)上,采用65℃進(jìn)行反應(yīng),每30 s采集一次FAM通道熒光信號(hào),根據(jù)最大△Rn值和最小Ct值確定體系中各個(gè)成分的最佳用量,并確定最終的反應(yīng)體系。

1.2.3 LAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化 采用優(yōu)化確定的反應(yīng)體系,將反應(yīng)溫度從60℃～65℃依次遞增,共6個(gè)反應(yīng)管,從多次重復(fù)試驗(yàn)中確定最佳反應(yīng)溫度。1.2.4 LAMP的敏感性確定 根據(jù)優(yōu)化的反應(yīng)體系建立LAMP檢測(cè)方法,取10倍倍比稀釋為101拷貝/μ L～107拷貝/μ L 的質(zhì)粒 DNA 做模板,通過實(shí)時(shí)熒光PCR儀檢測(cè)確定所建立LAMP方法的靈敏度,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。LAMP反應(yīng)結(jié)束后,離心,通過觀察白色沉淀的有無來判定結(jié)果;繼而將每個(gè)反應(yīng)管加入1 μ L預(yù)先用DMSO 10倍稀釋的SYBR Green進(jìn)行顯色,以顏色變化作為判定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)(綠色為陽性,橙色為陰性);每個(gè)反應(yīng)管取5 μ L用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 LAMP ASFV的特異性檢測(cè) 采用上述建立的ASFV LAMP檢測(cè)方法,以中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)植檢所動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存的虹彩病毒(RGV)、痘病毒等病毒 DNA以及豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)等cDNA材料作為對(duì)照樣品,試驗(yàn)同時(shí)設(shè)正常豬肌肉組織DNA作為陰性對(duì)照,檢測(cè)所建立方法的特異性。

1.2.6 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定 為了利于LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定,本研究設(shè)計(jì)在內(nèi)引物ASFFIP1的 F1位置的3′端引入 Bam HⅠ-GGATCC,同時(shí)在內(nèi)引物ASFBIP1的 B1位置的 3′端引入EcoRⅠ—GAATTC酶切位點(diǎn),于反應(yīng)結(jié)束后,分別采用BamHⅠ、EcoRⅠ對(duì) LAMP產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定。試驗(yàn)應(yīng)用20 μ L酶切體系,置于37 ℃酶切作用1.5 h,然后分別取5 μ L,于15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后紫外觀察。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果,確定的最佳反應(yīng)體系(25 μ L)如下:10×Thermopol buffer(2.5 μ L)、100 mmol/L MgSO4(1 μ L)、2.5 mmol/L dNTP(8 μ L)、3.2 mol/L Betaine(5 μ L)、5 μ mol/L ASFF31(0.5 μ L)、5 μ mol/L ASFB31(0.5 μ L)、20 μ mol/L ASFFIP1(1.2 μ L)、20 μ mol/L ASFBIP1(1.2 μ L)、8 U/μ L Bst DNA Polymerase(1.5 μ L)、Eva green(1 μ L)、待 檢 樣品(1 μ L)、ddH2O補(bǔ)至25 μ L。將反應(yīng)管置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中65℃反應(yīng)50 min,每30 s采集一次FAM通道熒光信號(hào)。

2.2 熒光PCR判定LAMP檢測(cè)方法的敏感性

從圖1和表1可以看出,隨著反應(yīng)體系中模板DNA含量的減少,反應(yīng)曲線Ct值逐漸增加。經(jīng)過多次試驗(yàn)得出所建立的ASFV LAMP方法采用熒光PCR判定結(jié)果時(shí)的最低檢測(cè)限為101拷貝(圖1中曲線7)。

2.3 觀察沉淀方法判定LAMP檢測(cè)方法的敏感性

LAMP反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)管離心,可在陽性反應(yīng)管底部看到明顯的白色沉淀,而陰性對(duì)照則看不到(圖2),據(jù)此判定采用沉淀觀察法判定LAMP檢測(cè)方法的敏感性為10拷貝(圖2中管7)。

2.4 凝膠電泳檢測(cè)判定LAMP檢測(cè)方法的敏感性

LAMP反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后,將凝膠置于凝膠成像儀下觀察,可見管1～6均有一系列大小不一的條帶,而管7和空白對(duì)照(管8)都沒有(圖3),即采用凝膠電泳方法判定ASFV LAMP檢測(cè)方法的敏感性為100拷貝。

2.5 根據(jù)顏色變化判定LAMP檢測(cè)方法的敏感性

LAMP反應(yīng)結(jié)束后,向每個(gè)反應(yīng)管中加入1 μ L 10倍稀釋的10 000×SYBR Green后混勻,可見管1～7均呈現(xiàn)綠色,而空白對(duì)照(管8)仍為橙色(圖4)。

圖1 非洲豬瘟病毒 LAMP檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果(單位:拷貝/μ L)Fig.1 T he sensitivity result of ASFV LAMP

表1 不同稀釋倍數(shù)非洲豬瘟病毒質(zhì)粒DNA與對(duì)應(yīng)Ct值Table 1 Different diluted ASFV plasmid DNA and corresponding Ct value

圖2 非洲豬瘟病毒LAMP檢測(cè)結(jié)果的判-沉淀觀察結(jié)果(箭頭處為離心后沉淀部位)Fig.2 T he detection of ASFV with LAMP-observation of precipitation(the arrow shows pellet after centrifugation

圖3 非洲豬瘟病毒LAM P檢測(cè)結(jié)果的判定-凝膠電泳檢測(cè)Fig.3 The detection of ASFV with LAMP-gel electrophoresis detection

圖4 非洲豬瘟病毒LAM P檢測(cè)結(jié)果的判定-顏色變化Fig.4 The detection of ASFV with LAMP-color reactivity

2.6 LAMP的特異性檢測(cè)

試驗(yàn)表明,建立的ASFV LAMP檢測(cè)方法具有良好的特異性,與RGV、痘病毒以及CSFV、PRRSV無交叉反應(yīng),也不受正常豬組織DNA的干擾。

2.7 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定

將ASFV LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物分別用BamHⅠ、EcoRⅠ進(jìn)行酶切,電泳結(jié)果表明,酶切產(chǎn)物均為單一大小的條帶,約150 bp大小,與LAMP擴(kuò)增設(shè)計(jì)的F2和B2間長(zhǎng)度(155 bp)相當(dāng)(圖5)。

圖5 非洲豬瘟病毒LAM P擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定Fig.5 Identification of ASFV with LAMP by enzyme digestion

3 討論

傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是目前檢測(cè)非洲豬瘟病毒的基因診斷技術(shù)中最常用的方法之一,但在特異性、簡(jiǎn)便程度、試劑儀器要求等方面存在不足[6]。新發(fā)展的環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)解決了目前基因檢測(cè)方法的弊端。該方法不需要模板的熱變性、長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程[7]。在LAMP反應(yīng)過程中,從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合,其反應(yīng)產(chǎn)物焦磷酸鎂乳白色沉淀即可通過肉眼觀察判定結(jié)果[8],或加入熒光染料,通過顏色變化來判定結(jié)果。LAMP反應(yīng)是在恒溫(60℃～65℃)條件下進(jìn)行的,這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環(huán)從而使得儀器簡(jiǎn)單化,反應(yīng)時(shí)間縮短。同時(shí),由于LAMP擴(kuò)增的4條引物涉及到靶序列的6個(gè)區(qū)段,原理上LAMP法擴(kuò)增的特異性高于PCR擴(kuò)增方法;同時(shí),由于反應(yīng)條件單一,省卻了變性過程,擴(kuò)增效率也得到提升,理論上的檢測(cè)敏感性為PCR方法的10倍～100倍[9-10]。本研究建立的ASFV LAMP檢測(cè)方法的靈敏性為10拷貝質(zhì)粒DNA。

從方法的敏感性比較結(jié)果可以看出,電泳觀察法敏感性較低,染色法雖然比較直觀但容易受引物二聚體非特異性著色的影響,利用熒光PCR可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的整個(gè)過程,且靈敏度高,但是PCR儀的缺點(diǎn)就是不適于攜帶、外出現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。江彥增等[9]根據(jù)LAMP恒溫?cái)U(kuò)增的特點(diǎn),采用恒溫水浴鍋建立了ASFV的LAMP檢測(cè)方法,半個(gè)小時(shí)即可觀察結(jié)果,該研究雖然解決了反應(yīng)簡(jiǎn)便、快速的難題,但是此方法不能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果,且結(jié)果的判定采用凝膠電泳檢測(cè),需經(jīng)過繁瑣的制膠、電泳以及凝膠成像系統(tǒng)觀察,如野外沒有凝膠成像系統(tǒng)同樣很難完成現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

目前專門用于LAMP檢測(cè)方法的濁度儀已經(jīng)上市,采用LAMP濁度儀進(jìn)行反應(yīng)可以直接實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程中的沉淀,效果更加明顯。該儀器便于攜帶、外出現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),如果將來可以解決DNA的現(xiàn)場(chǎng)快速提取,配合LAMP檢測(cè)的專用試劑,則可實(shí)現(xiàn)非洲豬瘟病毒的野外采用、現(xiàn)場(chǎng)結(jié)果判定,從而提高動(dòng)物檢疫工作的速度及準(zhǔn)確性。

由于LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物為環(huán)連接的長(zhǎng)鏈DNA,不同的擴(kuò)增片段難以通過電泳圖譜判定大小作出鑒定。本研究中,通過在擴(kuò)增引物中引入酶切位點(diǎn),在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后通過采用限制性內(nèi)切酶消化的方法,較好的實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性長(zhǎng)度檢測(cè)。

本研究建立的LAMP檢測(cè)方法為ASFV的檢測(cè)提供了新的思路,有望成為簡(jiǎn)易的常規(guī)檢測(cè)方法,尤其適用于基層獸醫(yī)診斷及檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)使用。

[1]曲連東,于康震.非洲豬瘟研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)科技,1998,28(11):42-43.

[2]王君瑋,張 玲,王志亮,等.非洲豬瘟傳入我國危害風(fēng)險(xiǎn)分析[J].中國動(dòng)物檢疫,2009,26(3):63-66.

[3]Yamazaki W,Taquchi M,Ishibashi M,et al.Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and simple detection of Campylobacter jejuniand Campylobacter coli[J].J M ed Microbiol,2008,57(Pt4):444-451.

[4]Tsai S M,Chan K W,Hsu W L,et al.Development of a loopmediated isothermal amplification for rapid detection of o rf virus[J].J Virol M ethods,2009,157(2):200-204.

[5]Guan G,Chauvin A,Luo J,et al.The development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification(LAMP)method for detection of Babesia spp.infective to sheep and goats in China[J].Exp Parasitol,2008,120(1):39-44.

[6]蔣正軍,龔振華,尹燕博,等.應(yīng)用PCR檢測(cè)非洲豬瘟病毒的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2000,22(增刊):114-117.

[7]肖 斌,朱永紅,鄒全明.簡(jiǎn)便敏感的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因診斷技術(shù)[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2005,28(7):761-763.

[8]Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28(12):E63.

[9]江彥增,朱鴻飛.非洲豬瘟病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī),2009,36(2):72-74.

[10]陳長(zhǎng)木,崔尚金,張超范,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒反轉(zhuǎn)錄環(huán)媒恒溫檢測(cè)方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,31(5):378-382.